使用两种CRISPR酶在20分钟内完成COVID新冠诊断
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FIND-IT 检测中用于检测 SARS-CoV-2 病毒感染的反应。当 Cas13 酶（左）与其靶 RNA 结合时，它会剪断一个分子（橙色和灰色）以释放一种激活剂（橙色），该激活剂会增强 Csm6 核酸酶（底部中心）以切割并释放发光的荧光标记（绿色）并发出病毒 RNA 存在的信号。图片由芝加哥大学普利兹克医学院的 Margaret L. Liu 提供
对COVID-19进行频繁、快速的检测对于控制疫情的传播至关重要，尤其是在出现新的、更易传播的变种时。
虽然今天使用 qRT-PCR（定量逆转录酶聚合酶链反应 (PCR)）的金标准 COVID-19 诊断测试非常敏感，每微升可检测到一个RNA拷贝，但它需要专门的设备，运行时间为几个小时和一个集中的实验室设施。因此，测试通常需要至少一到两天的时间。
由加州大学伯克利分校Jennifer Doudna、David Savage 和 Patrick Hsu 实验室的科学家领导的一个研究小组旨在开发一种比 qRT-PCR 更快、更容易部署的诊断测试。现在，它结合了两种不同类型的 CRISPR 酶，创建了一种可以在不到一个小时内检测到少量病毒 RNA 的检测方法。Doudna 因发明 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术而分享了 2020 年诺贝尔化学奖。
虽然这项新技术尚未达到与 qRT-PCR 的灵敏度相媲美的阶段，qRT-PCR 只能检测到每微升液体中的几个病毒拷贝，但它已经能够检测到病毒 RNA 的水平——大约 30 个拷贝每微升——足以用于监测人群并限制感染的传播。
“如果测试足够方便和快速，则基本上不需要 PCR 的敏感性来在社区中捕获和诊断 COVID-19，”共同作者、分子和细胞生物学教授 David Savage 说。“我们的希望是尽可能地推动生物化学的发展，让你可以想象一种非常方便的形式，在这样的环境中，你每天都可以接受测试，比如在上班的入口处。”
研究人员于 2021 年 8 月 5 日在《自然化学生物学》杂志上报告了他们的结果。
杜德娜获得 2020 年诺贝尔化学奖当天，蒂娜·刘和詹妮弗·杜德娜在 IGI 大楼外。图片来源：加州大学伯克利分校 Brittany Hosea-Small 拍摄
几种基于 CRISPR 的检测方法已获得美国食品和药物管理局的紧急使用授权，但都需要一个初始步骤，即扩增病毒 RNA，以便检测信号（包括释放在蓝光下发光的荧光分子）足够明亮，可以看到。虽然这种初始扩增将测试的灵敏度提高到与 qRT-PCR 相似的水平，但它也引入了使测试更难在实验室外进行的步骤。
加州大学伯克利分校领导的团队试图在不牺牲检测简单性的情况下达到有用的灵敏度和速度。
团队负责人 Tina Liu 表示：“对于即时医疗应用，您希望能够快速做出反应，以便人们能够在登机前或去探亲之前快速知道自己是否被感染。”创新基因组学研究所 (IGI) 的杜德纳实验室的研究科学家，该研究所是一个以 CRISPR 为重点的中心，涉及加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校的科学家。
除了增加一个步骤之外，初始扩增的另一个缺点是，由于它会产生数十亿份病毒 RNA，因此患者样本之间交叉污染的可能性更大。该团队开发的新技术扭转了这一局面，而是增强了荧光信号，消除了交叉污染的主要来源。
这种无扩增技术，他们称之为快速串联核酸酶检测 (FIND-IT)，可以为许多其他传染病提供快速且廉价的诊断测试。
“虽然我们确实启动这个项目是为了影响 COVID-19，但我认为这种特殊技术可能不仅仅适用于这种流行病，因为最终，CRISPR 是可编程的，”刘说。“因此，您可以在 CRISPR 酶上加载针对流感病毒或 HIV 病毒或任何类型 RNA 病毒的序列，并且该系统有可能以相同的方式工作。这篇论文确实证实了这种生物化学是一种更简单的检测 RNA 的方法，并且能够在敏感和快速的时间范围内检测到这种 RNA，这可能适用于未来的护理诊断应用。”
研究人员目前正在使用 FIND-IT 构建这样的诊断程序，其中包括收集和处理样本以及在紧凑型微流体设备上运行检测的步骤。
使用串联 Cas 蛋白
为了消除等式中的目标扩增，该团队使用 CRISPR 酶——Cas13——首先检测病毒 RNA，并使用另一种称为 Csm6 的 Cas 蛋白来放大荧光信号。
Cas13是用于切割RNA的通用剪刀；一旦它与由指导 RNA 指定的目标序列结合，它就会准备好切割广泛的其他 RNA 分子。这种目标触发的切割活动可用于将特定 RNA 序列的检测与荧光报告分子的释放相结合。然而，当存在非常少量的靶 RNA 时，Cas13 本身可能需要数小时才能产生可检测的信号。
Liu 的见解是使用 Csm6 来放大 Cas13 的效果。Csm6 是一种 CRISPR 酶，可感知 RNA 小环的存在并被激活以切割细胞中的各种 RNA 分子。
为了提高 Cas13 的检测能力，她和她的同事设计了一种特殊设计的激活剂分子，当 Cas13 检测到病毒 RNA 时会被切断。该分子的一个片段可以结合并触发 Csm6 切割并从一段 RNA 中释放出明亮的荧光分子。通常，激活剂分子会被 Csm6 快速分解，从而限制了它可以产生的荧光信号量。Liu 和她的同事设计了一种对激活剂进行化学修饰的方法，使其免受降解，并可以对 Csm6 进行增压，以反复切割和释放与 RNA 相连的荧光分子。这导致灵敏度比原始激活剂好 100 倍。
“当 Cas13 被激活时，它会切割这个小激活剂，去除一个保护它的片段，”刘说。“现在它被释放了，它可以激活第二种酶 Csm6 的许多不同分子。因此，Cas13 识别的一个目标不仅会激活其自身的 RNA 切割能力；它会导致产生更多活性酶，然后每种酶都可以切割更多的荧光报告分子。”
研究人员团队还整合了引导 RNA 的优化组合，使 Cas13 能够更灵敏地识别病毒 RNA。当它与 Csm6 及其激活剂结合使用时，该团队能够在短短 20 分钟内检测到每微升SARS-CoV-2 RNA 低至 31 个拷贝。
研究人员还将从患者样本中提取的 RNA 添加到微流体盒中的 FIND-IT 测定中，以查看该测定是否可以适用于在便携式设备上运行。使用带有摄像头的小型设备，他们可以检测从患者样本中提取的 SARS-CoV-2 RNA，其灵敏度可以在 COVID-19 感染高峰时捕获。
“这种串联核酸酶方法——Cas13 加 Csm6——在 37摄氏度的单一温度下将所有东西组合成一个单一反应，因此它不需要高温加热或多个步骤，这是其他诊断技术所必需的，”刘说。“我认为这为更快、更简单的测试提供了机会，这些测试可以达到与其他当前技术相当的灵敏度，并可能在未来达到更高的灵敏度。”
当大流行开始转向 COVID-19 诊断和治疗问题时，这种用于 RNA 检测的无扩增方法的发展是 IGI 内部研究重新定位的结果。最终，加州大学伯克利分校的五个实验室和加州大学旧金山分校的两个实验室参与了这个研究项目，这是 IGI 的众多实验室之一。
“当我们开始这个项目时，我们希望创造出与 PCR 相当但不需要扩增的东西——这将是梦想，”该项目的首席研究员 Savage 说。“从敏感性的角度来看，我们有大约一万倍的差距要跳跃。我们已经做到了大约一千倍；我们已经把它降低了大约三个数量级。所以，我们快到了。去年四月，当我们真正开始规划时，这似乎几乎是不可能的。”
参考文献：Tina Y. Liu、Gavin J. Knott、Dylan CJ Smock、John J. Desmarais、Sungmin Son、Abdul Bhuiya、Shrutee Jakhanwal、Noam Prywes、Shreeya Agrawal、María Díaz de León 的“使用串联 CRISPR 核酸酶加速 RNA 检测” Derby、Neil A. Switz、Maxim Armstrong、Andrew R. Harris、Emeric J. Charles、Brittney W. Thornton、Parinaz Fozouni、Jeffrey Shu、Stephanie I. Stephens、G. Renuka Kumar、Chunyu Zhao、Amanda Mok、Anthony T. Iavarone、Arturo M. Escajeda、Roger McIntosh、Shineui Kim、Eli J. Dugan、IGI 测试联盟、Katherine S. Pollard、Ming X. Tan、Melanie Ott、Daniel A. Fletcher、Liana F. Lareau、Patrick D. Hsu、 David F. Savage 和 Jennifer A. Doudna，2021 年 8 月 5 日，自然化学生物学。
DOI: 10.1038/s41589-021-00842-2
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这项工作得到了国防高级研究计划局 (N66001-20-2-4033) 的支持。该论文的共同作者包括加州大学伯克利分校的 Jennifer Doudna、David Savage、Patrick Hsu、Liana Lareau 和 Daniel Fletcher 实验室的成员；澳大利亚莫纳什大学的 Gavin Knott；Gladstone Institutes 和 UCSF 的 Melanie Ott 和 Katherine Pollard；和位于加利福尼亚州普莱森顿的研发公司 Wainamics 的 Ming Tan，该公司生产微流体设备。Doudna 是 IGI 的创始人，现任 IGI 治理委员会主席兼主席，是加州大学伯克利分校李嘉诚校长的主席，也是化学和分子与细胞生物学教授。Hsu、Lareau 和 Fletcher 是生物工程系的教师。