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纳米技术以近原子分辨率实现关键RNA结构的3D可视化

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ROCK 方法的艺术类比

这幅插图的灵感来自拉斯科洞穴中的旧石器时代岩画,表示我们方法的首字母缩略词 ROCK。形象地说,背景中的岩石艺术图案(棕色)是四膜虫 I 组内含子的工程二聚体结构的 2D 投影,而前面的主要对象(蓝色)是重建的 3D 冷冻电镜图。二聚体,聚焦一个单体,并精炼到高分辨率,使合作者能够建立 RNA 的原子模型。图片来源:哈佛大​​学威斯研究所

核酸纳米技术和冷冻电镜的结合为大 RNA 和小 RNA 的结构提供了前所未有的见解,推进了RNA生物学和药物设计。

我们生活在一个由 RNA 创造和运行的世界,RNA 是基因分子DNA的同等重要的兄弟姐妹。事实上,进化生物学家假设 RNA 甚至在 DNA 出现之前就存在并自我复制。快进到现代人类:科学表明,不到 3% 的人类基因组被转录成信使 RNA (mRNA) 分子,而信使 RNA (mRNA) 分子又被翻译成蛋白质。相比之下,其中 82% 被转录成具有其他功能的 RNA 分子,其中许多功能尚不清楚。

核糖核酸 (RNA)是一种聚合分子,在基因的编码、解码、调节和表达中的各种生物学作用中是必不可少的。RNA和脱氧核糖核酸(DNA)都是核酸。与脂质、蛋白质和碳水化合物一起,核酸构成了所有已知生命形式所必需的四种主要大分子之一。RNA 与 DNA 一样,组装成核苷酸链,但与 DNA 不同的是,RNA 在自然界中以单链形式折叠到自身上,而不是成对的双链。

要了解单个 RNA 分子的作用,需要在其组成原子和分子键的水平上破译其 3D 结构。研究人员经常研究 DNA 和蛋白质分子,方法是将它们变成规则堆积的晶体,可以用 X 射线束(X 射线晶体学)或无线电波(核磁共振)检查。然而,这些技术不能以几乎相同的效率应用于 RNA 分子,因为它们的分子组成和结构灵活性阻止它们容易形成晶体。

现在,由 Wyss Core 教员 Peng Yin 博士领导的一项研究合作。在哈佛大学 Wyss 仿生工程研究所和 Maufu Liao 博士。在哈佛医学院 (HMS),报告了一种全新的 RNA 分子结构研究方法。ROCK,正如它所说的那样,使用一种 RNA 纳米技术,可以将多个相同的 RNA 分子组装成高度有序的结构,从而显着降低单个 RNA 分子的灵活性并使其分子量成倍增加。研究小组将具有不同大小和功能的著名模型 RNA 用作基准,表明他们的方法能够使用称为低温电子显微镜 (cryo-EM) 的技术对所含 RNA 亚基进行结构分析。他们的进展在杂志上报道自然方法

“ROCK 正在打破目前 RNA 结构研究的限制,并能够以近原子分辨率解​​锁现有方法难以或不可能访问的 RNA 分子的 3D 结构,”Yin 说,他与 Liao 一起领导了这项研究. “我们预计这一进展将振兴基础研究和药物开发的许多领域,包括新兴的 RNA 治疗领域。” Yin 还是 Wyss 研究所分子机器人计划的负责人,也是 HMS 系统生物学系的教授。

“ROCK 正在打破目前 RNA 结构研究的限制,并能够以近原子分辨率解​​锁现有方法难以或不可能访问的 RNA 分子的 3D 结构。我们预计这一进展将振兴基础研究和药物开发的许多领域,包括新兴的 RNA 治疗领域。”

彭寅

获得对 RNA 的控制

威斯研究所的尹教授团队开创了各种方法,使 DNA 和 RNA 分子能够根据不同的原理和要求自组装成大型结构,包括DNA 砖和DNA 折纸。他们假设这种策略也可用于将天然存在的 RNA 分子组装成高度有序的环状复合物,通过将它们特异性连接在一起,它们的弯曲和移动自由度受到高度限制。许多 RNA 以复杂但可预测的方式折叠,小片段彼此碱基配对。结果通常是稳定的“核心”和“茎环”向外围凸出。

岩石核糖核酸

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在 ROCK(通过安装接吻环实现 RNA 寡聚化的冷冻电镜)中,目标 RNA 被设计用于通过安装在功能无关的外围螺旋(蓝色)上的接吻环序列(红色)自组装闭合同聚环)。在识别出可工程化的非必需外周螺旋后,连接接吻环基序和目标 RNA 核心的螺旋长度经过计算优化。具有多个目标 RNA 单个亚基的 RNA 构建体被转录、组装,然后通过凝胶电泳纯化,然后可以通过冷冻电镜方法进行分析。图片来源:哈佛大​​学威斯研究所

“在我们的方法中,我们安装了‘接吻环’,它将属于相同 RNA 的两个拷贝的不同外周茎环连接起来,从而形成一个整体稳定的环,其中包含多个感兴趣的 RNA 拷贝,”Di 说刘博士,两位第一作者之一,尹氏课题组博士后。“我们推测这些高阶环可以通过cryo-EM进行高分辨率分析,该技术已首次成功应用于RNA分子。”

描绘稳定的 RNA

在低温 EM 中,许多单个粒子在低温下被快速冷冻以防止任何进一步的运动,然后通过电子显微镜和计算算法的帮助进行可视化,这些算法比较粒子的 2D 表面投影的各个方面并重建其 3D 结构. Peng 和 Liu 与 Liao 和他的前研究生 François Thélot 博士合作,后者是该研究的另一位共同第一作者。Liao 和他的团队为快速发展的低温电磁场以及特定蛋白质形成的单个粒子的实验和计算分析做出了重要贡献。

“与传统方法相比,Cryo-EM 在查看包括蛋白质、DNA 和 RNA 在内的生物分子的高分辨率细节方面具有很大优势,但大多数 RNA 的小尺寸和移动趋势阻碍了 RNA 结构的成功确定。我们组装 RNA 多聚体的新方法通过增加 RNA 的大小并减少其运动,同时解决了这两个问题,”同时也是 HMS 细胞生物学副教授的廖说。“我们的方法为通过冷冻电镜快速测定许多 RNA 的结构打开了大门。” RNA 纳米技术和冷冻电镜方法的整合使该团队将他们的方法命名为“通过安装接吻环实现 RNA 寡聚化的冷冻电镜”(ROCK)。

为了为 ROCK 提供原理证明,该团队专注于来自单细胞生物四膜虫的大内含子 RNA 和来自固氮细菌Azoarcus的小内含子 RNA ,以及所谓的 FMN 核糖开关. 内含子 RNA 是散布在新转录的 RNA 序列中的非编码 RNA 序列,必须“剪接”出来才能生成成熟的 RNA。FMN 核糖开关存在于与维生素 B2 衍生的黄素代谢物生物合成有关的细菌 RNA 中。在结合其中一种黄素单核苷酸 (FMN) 后,它会转换其 3D 构象并抑制其母 RNA 的合成。

启用 ROCK 的结构

在对四膜虫 I 组内含子的分析中,研究人员收集了大约 105,000 张启用 ROCK 结构的单粒子低温 EM 图像,并通过一系列计算分析步骤重建了其结构,总分辨率达到 2.98 Å,并且结构核心的分辨率为 2.85 Å。最终模型提供了四膜虫 I 组内含子的详细视图,包括以前未知的外围结构域(以棕色和紫色显示),它们构成围绕核心的带。图片来源:哈佛大​​学威斯研究所

“将四膜虫I 组内含子组装成环状结构使样品更加均匀,并能够利用组装结构的对称性使用计算工具。虽然我们的数据集规模相对较小,但 ROCK 的先天优势使我们能够以前所未有的分辨率解析结构,”Thélot 说。“RNA 的核心分辨率为 2.85 Å [1 Ångström 是一百亿 (US) 米,是结构生物学家使用的首选度量标准],揭示了核苷酸碱基和糖骨架的详细特征。我认为如果没有 ROCK,我们就无法实现这一目标——或者至少在没有更多资源的情况下无法实现。”

Cryo-EM 还能够捕获处于不同状态的分子,例如,如果它们改变其 3D 构象作为其功能的一部分。将 ROCK 应用于Azoarcus内含子 RNA 和 FMN 核糖开关,该团队设法识别了Azoarcus内含子在其自剪接过程中转变的不同构象,并揭示了 FMN 核糖开关配体结合位点的相对构象刚性.

“彭寅和他的合作者的这项研究优雅地展示了 RNA 纳米技术如何作为促进其他学科发展的加速器。能够可视化和理解许多天然存在的 RNA 分子的结构,可能会对我们理解不同细胞类型、组织和生物体的许多生物学和病理过程产生巨大影响,甚至可以实现新的药物开发方法,”Wyss 创始董事说Donald Ingber,医学博士,博士,他也是哈佛医学院和波士顿儿童医院的Judah Folkman 血管生物学教授,以及哈佛约翰A. 保尔森工程与应用科学学院的 Hansjörg Wyss 仿生工程教授.

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