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如何测定叶绿体完整度?

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叶绿体完整度如何测定?

叶绿体
 
叶绿体被膜完整度的测定

【原理】
由于铁氰化钾不能透过被膜,故完整叶绿体在等渗介质中不能进行铁氰化钾光还原的Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体,铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。根据这一原理,比较胀破与未胀破的叶绿体Hill反应速率,就可计算叶绿体被膜的完整度。
 
【仪器与用具】
氧电极测氧全套装置(见实验20);烧杯;微量进样器;洗耳球等。
 
【试剂】
    测定介质Ⅰ和Ⅱ  见一。
    100mmol/L铁氰化钾:称3.29g铁氰化钾溶于水,定容至100ml。
    100mmol/L NH4Cl:称0.54g NH4Cl溶于水,定容至100ml。
    适量叶绿体(20~50μg Chl/ml反应体系)。
    【方法】
    1.取0.1ml叶绿体提取液加到0.9ml的蒸馏水中并搅拌1min,使叶绿体被膜胀破,加1ml测定介质Ⅰ悬浮备用。
    2.取0.1ml未胀破叶绿体提取液加入反应杯中,视反应杯体积加入测定介质Ⅱ,加入适量铁氰化钾和NH4Cl,使铁氰化钾和NH4Cl的最终浓度都为1mmol/L。搅拌,平衡1min,照光测定Hill反应放氧速率,记录5min,然后清洗反应杯。
    3.将已胀破叶绿体加入反应杯中,再加入适量测定介质Ⅱ、铁氰化钾和NH4Cl,使反应体系物质最终浓度同未胀破叶绿体测定体系,测定过程同2。
    4.分别计算胀破和未胀破的叶绿体测定体系中单位时间的放氧量(或Hill反应速率)。
    5.计算被膜完整度。
被膜完整度(%)=
式中  A-胀破叶绿体单位时间内的放氧量(或Hill反应速率)
B-未胀破叶绿体单位时间内的放氧量(或Hill反应速率)
 
【注意事项】

    1. 本实验所用试剂要存放在冰箱中,存放时间不宜过长,最好现配现用。
    2. 叶绿体的分离要在0~4℃下进行,玻璃器皿和溶液都须预冷,操作要快,整个分离过程最好在5min内完成。
    3. 离心过程中离心机的转速不宜过高,否则叶绿体中的淀粉粒会打破叶绿体被膜。
    4. 被膜完整度的测定过程中,反应杯内破碎叶绿体与完整叶绿体的叶绿素含量应相等。