光学显微术-比色法

下面是一个阐明如何设置和运行比色法断定的是在溶液中的一种物质，的浓度。

一般方式

在显微镜下，我们不能把资料和计数每单位体积的分子数的方式，我们可以盘算每单位体积的细胞数。我们必需找到的显微镜，我们可以测量浓度的物质好处是成正比的。在试验中使用的最常用的测量光接收。比尔定律告知我们，如果溶质吸收特定波长的光，吸光度在溶液中的物质浓度成正比。一个装备称为分光光度计是用于丈量并显示在可量化的单位和/或记载吸光度。通常情形下，物质本身不接收光线，以便为实际检测。我们可能不得不雇用一个或多个生产中的比例未知浓度的有色化合物的试剂。

测量样品的光吸收告知我们很少的，除非我们有一个比拟标准。例如，如果样品X显示吸光度为0.5，什么是X的实际浓度？如果我们有一个已知浓度的样品，样品也给了0.5吸光度的，那么我们有理由信任，该物质具有相同浓度。假设你有一个样品的数目，其浓度变更。这将是有益的，有一个标准，涵盖了全方位我们未知的浓度可能的数量。这就是标准曲线。我们准备了一系列的已知浓度的X标准，从低到高浓度。我们运行的每一个标准的检测和情节吸光度与浓度。应用此标准曲线，我们可以读出浓度为未知其吸光度浏览。

把持

当我们运行一个试验，我们必须确保只有我们化验的物质是光吸收的波长范围内的好处负责。应坚持雷同的标准和未知的所有预备条件。如果样本缓冲区中的溶质影响吸光度，然后我们有一个问题。我们将无法获得正确的结果，如果我们不同的卷中，我们筹备和检测标准和未知。读取吸光度的时光，我们坚持温度下的资料，和所有其他物理因素应坚持不变。由于它并不总是可行的，所有的未知和标准使用雷同的缓冲区的，我们只需要确保没有任何缓冲区的组成部分，吸光度显着的后果。

当我们用相同体积的所有标准和未知的，我们简化了相当的剖析。标准曲线的绘制吸光度与物质，而不是集中量。这可能是与工作，而做一个实验金额减少混杂，尤其是假如需要稀释。只要你知道在实验中使用的样本，原始卷，浓度测定是很轻易的。

并发症

所有的检测有很大的局限性。一些最低限度以下物质的金额将被检测到。除了一些最大的量或浓度趋于饱和，这是一个试验，在数量或浓度的增添不会影响吸光度。我们一般会尝试一个实验，即吸光度成正比集中的线性范围内的工作。幻想的情形下，我们将设立标准，涵盖全部有用的检测范围。也就是说，我们优化的检测范围。

通常一个样品是如此集中，当你检测样品规定的量，结果是封闭的规模 – 检测试剂是饱和的。该解决计划则是稀释样品。例如，如果每个标准品或样品量是1毫升，1毫升你未知，给出一个成果是封闭范围，可以参加0.9 ml缓冲，0.1 ml样品试管。如果你读了从标准曲线的浓度，然后乘以10的结果，得到样品的实际浓度。如果你读的金额，然后从标准曲线简略地除以0.1毫升的量，以获得你的注意力。

当样本是如此集中，你不能吸管一个足够小的金额正确，您可能要进行系列稀释。

例：预备一个标准曲线

我们将成立一个假设性的试验来丈量物资X确当X混杂，形成一个庞杂的检测试剂，接收光波长为400毫微米。我们的分光光度计请求，我们在每个试管2 ml量。一个反映杯中是一个透明的容器必需放置在光路测量吸光度。为了得到准确的比例进行采样检测试剂，我们使我们的样本量0.5毫升，参加1.5毫升显色剂，以每管。以这种方法检测，可以检测到低至10微克（μg）的X金额为2毫克（mg）。

参考

要校准分光光度计，我们须要一个参考管是雷同的，在每一个方面的标准和样品，但它不包括任何物质与光路径十，禁止分光光度计将设置为只读无穷吸光度（不透光在所有）。随着在光路中的参考管，我们会设置的分光光度计读取零吸光度。这样一来，样品含有X将在该范畴内的吸光度。参考管是用来给我们的最大的动态范畴。

对于这个假设的例子将包括参考0.5毫升样品缓冲液和显色剂1.5毫升。

标准

这个例子描写了一个假设的检测仅用于阐明目标。

我们盼望，我们可以得到的最佳精度，和我们的产品规模跨越两个数量级，所以设立的标准曲线的方式之一是与一个标准的对数进展。我们需要从0.01毫克，2毫克的标准。让我们尝试金额为0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1和2毫克。最后的差距是相当普遍的，所以让我们抛在一个标准的，也就是说，1.5毫克。要准备的标准，它是便利的开端与该物质的浓缩原液。我们所须要的数额最大的是2毫克，在一个体积为0.5 ml。只给我们一点点的“盘旋余地”让我们做一个原液5毫克/毫升的物质X，下表列出了盘算。

表1。如何计划一个尺度曲线的例子。中的蛋白原液的浓度为5毫克/毫升。这个例子是仅用于阐明目标。

amount of substance X (mg)	volume of stock solution (µl)	volume of buffer (µl)
0 (reference)	0	500
0.01	2	498*
0.02	4	496*
0.05	10	490
0.1	20	480
0.2	40	460
0.5	100	400
1	200	300
1.5	300	200
2	400	100

*使用移液器，让我们卷不超过2个有效数字是精确的，它是常见的。

缓冲液原液量的要害。奏乐缓冲区中的过错影响总量，因此，显色剂的浓度。不到1％的过错，不会有结果的一个显着的后果。事实上，假如显色剂的体积远远超过样本量（而不是在这种情形下），我们不会甚至需要参加缓冲液，以平衡卷。

一些试验室都没有配备精度低于5μL移液器。它可能须要进行系列稀释得到的，说，检测管2个或4个μL原液。

样品制备

它有助于样品的浓度，可以预期的范围内有一个公道的估量。即使有这样的估量，它是很好的预备一系列的稀释样品，如果样品是如此集中，其吸光度读数范围。

检测的例子，如果我们用500μL样品检测管（最大音量），其浓度必需低于4毫克/毫升，以供给一个可读的吸光度。另一方面，我们盼望如果样品，说那么多，少10倍浓缩。懂得对某一样本的浓度一无所知，我们会用500μl负载一管笼罩范围。由于检测跨越的浓度范围内，我们可以使用在第二个检测管50μL。现在样品可以作为集中为40毫克/毫升，我们仍然会在检测管中有4毫克或更少，给人一种可读的结果。要笼罩所有的基地，我们可以只有5μL样品的检测与第三管。

运行检测

当所有的尺度和未知筹备，我们将有：

1参考管

一些标准，涵盖了全方位的检测

每个样品检测管两个或三个，代表了一系列的稀释

它是时光来进行颜色的发展，这可能是添加显色剂，让样品坐在了几分钟的简略程序。当实际，每个标准和样品处置应定时，以便读取吸光度后，每管相同的时光间隔。应校准仪器，然后应采用每管吸光度为了。标准曲线是通过绘制吸光度与物质X.的数目，假如关系显然是线性的，甚至没有必要的标准曲线。使用插值，可断定的金额。一个曲线应该树立一个实验是首次使用，检讨精度和线性度。

标准曲线的典范

这里是什么情节可能看起来像在实验室的笔记本（学生显明具有精良的手写）。关系不是完整线性的，而它显示了一个典范的灭尽模式。

由于如此普遍的规模内，供给非常低的吸光度读数的样本的学生可能会想要第二个更高辨别率的情节。

断定样品的浓度

A的浓度是每单位体积的显微镜数目。我们通常报告毫克每毫升（mg / ml的）的蛋白质浓度，固然有时可以很便利使用微克/微升（μg/μL的）或什至微克/毫升（浓度非常小）。对于一个未知的，我们除以样品在实验中应用的量物资的量（从尺度曲线）。请注意，这个量是不是检丈量，也不是稀释后的样品量。未经稀释的样本量除以放置在检测管。

让我们假设你筹备3个检测管，1＃样品，含500μL，50μL，5μL样品，分辨。假设他们给的0.86，0.12和0.01吸光度读数，分离。封闭规模，当然最后的吸光度。截距应为零，但我们不能指看在非常低的吸光度给我们足够准确的读数。\

0.86与1.7毫克的物质X的体积对应的吸光度为500μL（0.5毫升），所以我们得到浓度为3.4毫克/毫升。这听起来不错。检讨其他可读管，吸光度为0.12，表明管含有0.20毫克的物资X的体积为50μL（0.050毫升）。浓度应为0.20 mg/0.050毫升= 4.0毫克/毫升。我们应用的成果，还是我们取一个均匀值？

我发明，使用一个吸光度读数低于最接近的敏感范畴内的中间，最正确的成果。在上述中心的例子是0.5 asorbance，相当于0.1毫克物质。吸光度范围是对数，因此，即使从数字显示的读数是在低真个范围更可靠。然而，在非常低的吸光度的一个或更多的未知因素，如样品管或比色皿中的缺点，，将有更深远的影响就比在较高的吸光度的吸光度值。显色剂在上真个规模内接近饱和，因此，你不仅少吸光度读数之间的辨别率，但试剂不敏感蛋白浓度的差别。

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