探索多光子荧光显微镜

上世纪90年代对三光子显微镜进行了探索，但当时的激光技术限制了它的应用。但是现在，随着激光技术的进步，科学家开始再次挖掘这一技术的潜力，并透过大脑看到前所未有的深度。当康奈尔大学的物理学家ChrisXu还是康奈尔的研究生时，他就开始了多光子荧光显微镜的研究工作，那时是上世纪90年代。，这一技术在当时是全新的，因为那时WinfriedDenk，WattWebb和JimStrickler开发的双光子显微镜才刚刚面世。尽管当时对三光子的潜力已有了解并着手正在开发，但由于激光技术尚不成熟，三光子无法有效发挥其作用。结果，双光子荧光显微镜就成了主流。

足够强大

多光子荧光显微镜（MFM）生成高分辨率的图像，具有无与伦比的高选择性，它仅对被荧光染料标记的物体成像。与共聚焦荧光显微镜相比，MFM的优点是能够对更深层次的组织进行成像。这种技术尤其受神经生物学家的欢迎，因为这使得他们能够对单个突触进行成像，能够用于脑切片或活体、完整的实验动物。

“如果你真想知道大脑在干什么，你得在细胞水平上进行观察。”KevinEliceiri说，Kevin是威斯康星大学麦迪逊分校光学显微镜高级专家以及光学和计算仪器实验室主管。”多光子显微镜是你能以高分辨率观察深部组织内的细胞运动的唯一方法。

“要运行MFM，研究者首先需要向样本内引入荧光团。这种化学物质是一种染料，在激发状态下会发射荧光。然后聚焦激光束通过光栅针孔形成点光源，发射出长波长的光子，当多光子（双光子显微镜为两个光子，三光子显微镜则为三个光子）同时被吸收后，荧光团中的电子被激发至更高的能量状态。随着电子的衰减，它发射出荧光信号，然后被显微镜捕获。在MFM中，激发波长较辐射波长长–这和传统的荧光显微镜正好相反。

但和这一技术所能带给我们的惊喜一样，它也有缺陷，特别是考虑到散射和折射率的问题，它到底能看得多深？如果研究者使用长波长的光子，他们可以穿透更深的标本进行成像，因为这样的光子不易发生散射。当波长接近1300nm范围时，样本中的水开始吸收光子，光子于是变得没有用了。所以直到现在，三光子显微镜是否能替代双光子对更深的标本进行成像的问题还难以回答。

Xu的工作表明尽管存在水吸收窗，三光子荧光显微镜已足够强大，因此在很多情况下你依然能够看得很清楚。何况，更长的波长似乎并不像以前想象的那样会损伤细胞。

激光

激光技术的最新进展是三光子显微镜变得高效和可行的关键。继研究生阶段研究过多光子成像后，Xu在电信业研究光纤，这给了他激光技术方面的宝贵经验。”我们创造了我们自己的激光系统，”Xu说。”有了这个系统，就不再需要那么大的功率，只需20毫瓦便足以生成超高质量的图像了。这比双光子激光器的功率低多了。

“Xu开发的激光器拥有高脉冲能量低脉冲重复频率，比标准的双光子的钛蓝宝石激光器更有效，更适合三光子显微镜。开始的时候，他用光纤激光器产生了一种1550nm波长的激光，这是电信行业的标准波长。然后，他利用光子晶体杆移动激光波长至1700nm，通过形成一种称为孤波的波将能量放大100，000倍，这使得激光以恒定速率运动时保持波形不变。

这个杆是一种有着特殊外围结构的玻璃，因此当激光穿过它时，能保持其空间分布。”我知道杆越大，光纤越多，能量也越多。所以我在想，我们到底能把它变得多大？在这个方向上我们能走多远？”Xu回忆道。于是他和共同作者FrankWise共同探讨了他的想法，Frank也是康奈尔大学的一名物理学家。”‘我有一个好主意，'”Xu告诉Wise。’我需要一个大而长的杆来产生孤波，我能让这一能量变得非常有用。'[Wise]说，’哦，我有一个这样的杆’，事实上，我们第二天就找到了它，发射了一次脉冲，是的，能量就上去了。

“除了Xu，其他研究人员也开始再次研究三光子荧光显微镜。2012年2月，英国格拉斯哥斯特莱斯克莱德大学的物理学家GailMcConnell及其同事在《显微镜学杂志》上发表的文章表明，他们的三光子显微镜也能安全而有效地产生图像。

和Xu一样，McConnell也开发了一套她自己的三光子显微镜激光器，她开发的是一种双向抽运的光学参量振荡器。除了和Xu的激光器一样是一种发射1500nm波长激光的光纤激光器，McConnell的激光器还有另外一个特征：可调节性。因此她能够调节波长，这给了她一定的灵活性。

尽管她的团队有一些未发表的研究结果，是关于对哺乳动物细胞进行的观察，他们已发表的论文是对植物细胞进行成像，表明细胞并没有因为功率的增加而受到损伤。”我们可以想象四光子，”她说，”相比而言，用钛蓝宝石激光器五分钟后就会看到损伤。”下一步，McConnell说，是要将分辨率提至更高，这是他们实验室正在积极努力的方向。

三个，四个还是更多个

如果三光子能够做得好，为什么不用四个呢？额，如果是四光子，那么你需要更多的光子和更明亮的激光，这会对细胞产生更大的损伤。考虑到这一技术是专门用于对活体进行成像，那这种损伤就有问题了。”这么做你可能需要一些条件，”Xu说。”你需要重新进行优化。我们还没有达到三光子的深度极限。

“总体而言，在开发和优化三光子显微镜的过程中，相当多的潜力还有待挖掘，据Xu说。”我们能够开发出更好的对比试剂，更好的光学设备，还可能用更少的功率获得同样的信号，以及优化收集光子的系统。我们也许可以每件事情都做得比现在好一个数量级，加起来就比现在好1000倍了，这可不是一点点。”因为现在，三光子似乎拥有最好的吸收和散射平衡。显而易见，Xu和McConnell的工作引起了兴奋。”这两篇文章都表明了三光子显微镜拥有巨大的潜力。”Eliceiri说。”这份工作指出了考察其他波长的重要性，应该要做些试验看看都能得到些什么结果。但这篇文章表明红外真的很有希望。”有了这一新的工具，就能对脑中深部的单个神经元产生高分辨率的三维图像，科学家很可能会对大脑是如何工作的知道得更多。

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