上海光学仪器厂

显微镜观察粉尘颗粒

技术支持

做粉尘分析一般会做几个方面的研究：观察粉尘表面结构，测定粉尘的分散度，粉尘粒度的研究，粉尘颗粒计数等等。

那么针对不同方向的研究，所要求看到的粉尘大小和状态都不尽一样，在做何种实验的时候应该选用什么样的显微镜来进行观察，什么类型的显微镜最适合做什么粉尘样品的观察，可以配套什么软件对粉尘颗粒进行分析处理和研究。

首先，需对粉尘进行分类，关于粉尘有多种分类方法。
1、按物质组成分类：按物质组成粉尘可分为有机尘、无机尘、混合尘。有机尘包括植物尘、动物尘、加工有机尘；无机尘包括矿尘、金属尘、加工无机尘等。
2、按粒径分类、按尘粒大小或在显微镜下可见程度粉尘可分为：粗尘，粒径大于40?m,相当于一般筛分的最小粒径；细尘，粒径10~40?m，在明亮光线下肉眼可以见到；显微尘，粒径0.25~10?m，用光学显微镜可以观察；亚显微尘，粒径小于0.25?m，需用电子显微镜才能观察到。不同粒径的粉尘在呼吸器官中沉着的位置也不同，又分为：可吸入性粉尘即可以吸入呼吸器官，直径约大于10?m的粉尘；微细粒直径小于2.5?m的细粒粉尘，微细粉尘会沉降于人体肺泡中。
3、按形状分类、不同形状的粉尘可以分为：

（1）三向等长粒子，即长、宽、高的尺寸相同或接近的粒子，如正多边形及其他与之相接近的不规则形装的粒细子；

（2）片形粒子，即两方向的长度比第三方向长得多，如薄片状、鳞片装粒子；

（3）纤维形粒子，即在一个方向上长得多的粒子，如柱状、针状、钎维粒子；

（4）球形粒子，外形圆形或椭圆形。
4、按物理化学特性分类、由粉尘的湿润性、黏性、燃烧爆炸性、导电性、流动性可以区分不同属性的粉尘。如按粉尘的湿润性分为湿润角小于90。的亲水性粉尘和湿润角大于90。的疏水性粉尘；按粉尘的黏性力分为拉断力小于60Pa的不粘尘，60~300Pa的微粘尘，300~600Pa的中粘尘，大于600Pa的强粘尘；按粉尘燃烧、烛花 炸性分为易燃、易爆粉尘和一般粉尘；按粉料流动性可分为安息角小于30。的流动性好的粉尘，安息角为30。~45。的流动性中等的粉尘及安息角大于45。的流动性差的粉尘。按粉尘的导电性和静电除尘的难易分为大于1011Ω?cm的高比电阴粉尘，104~1011Ω?cm的叫比电阻粉尘，小于104Ω?cm的低比电阴粉尘。
5、其他分类中还有分为生产性粉尘和大气尘，纤维性粉尘和颗粒状粉尘，一次扬尘和二次性扬尘等。
目前国内外现有的粉尘粒度测定方祛,从原理上可分为三大类:显微镜法、沉降法和分级法。其中显微镜法是唯一可以观察和测量单个颗粒的方法,常被视为颗拉分析较完美的方法。
实例说明：利用显微镜粉尘分散度测定方法
（一）滤膜溶解涂片法
1、原理 将采有粉尘的滤膜溶于乙酸丁酯中，搅拌均匀，制成粉尘标本，在显微镜下计测。
2、试剂与器材 乙酸丁酯（CP），显微镜，目镜及物镜测微尺
3、操作步骤 采尘滤膜放在小烧杯中，加1—2ml乙酸丁酯搅拌均匀，制成粉尘标本。在400～600倍的放大倍率下，用目镜测微计测定粉尘粒子的大小。只少测定200个粒子，遇长经量长径，遇短径量短径。按＜2μm、2μm-、5μm-，＞10μm分挡进行记录，并求其百分比（%）。
（二）自然沉降法
1、原理 将含尘空气采集于沉降器内，使尘粒自然沉降在盖玻片上，制备标本、在显微镜下计测。
2、器材 格林沉降器，显微镜，目镜及物镜测微计
3、操作步骤 将盖玻片放在沉降器的凹槽内。将含尘空气臵于沉降器的圆筒内。水平静止3小时后，取出盖玻片，制备粉尘样品。测定粉尘粒子分散度时，自然沉降法与滤膜溶解涂片法的分散度计数方法相同。
根据各种不同的实验类型，可知对粉尘做研究可能会用到的显微镜类型有生物显微镜，金相显微镜，相衬显微镜，暗场显微镜，体视显微镜。不同显微镜可对粉尘做不同的分析和放大。

显微镜：http://www.shoif.com/old_version/industry/

体视显微镜使用方法

技术支持

立体显微镜又称“实体显微镜”或“解剖镜”，在观察物体时能产生正立的三维空间影像。立体感强，成像清晰和宽阔，又具有长工作距离，并是适用范围非常广泛的常规显微镜。操作方便、直观、检定效率高，适用于电子工业生产线的检验、印刷线路板的检定、印刷电路组件中出现的焊接缺陷（印刷错位、塌边等）的检定、单板PC的检定、真空荧光显示屏VFD的检定等等，配测量软件可以测量各种数据。

使用方法

细菌抹片标本的制备

技术支持

1.抹片

根据所用材料不同，抹片的方法亦有差异

(1)固体培养物

用经酒精灯火焰烧灼灭菌后的接种环，蘸取无菌蒸馏水(无菌肉汤、生理盐水均可)一环于清洁无油脂的载玻片中央，再钩取细菌的固体接着物少许混于蒸镏水中，涂抹成直径为1—1．5cm大小的均匀菲薄的抹片。

(2)液体培养物

可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1．2环，涂抹于玻片上即可。但应注意净管底Iili物摇匀，以免影响涂片效果。

(3)组织涂片

用灭菌的剪刀镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为肝脾组织，脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。无论何种方法，切忌

2.干燥  将抹片置于空气中让其自然干燥

3.固定  固定的方 法因材料不同而异：

(1)火焰固定

细菌培养物抹片，常采用火焰固定法，即将已干

燥的抹片菌膜面向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次(用手背触及抹片反面，以不烫手为宜)。

(2)化学固定

血液、组织等抹片常用此法固定，即以数滴甲

醇滴加在玻片上，固定3．5min。

抹片经固定后便粘附于玻片上而不易被水冲掉，并能改变细菌对染料的通透性，增加与染料的亲和力而更容易着色，同时多数细菌能被杀死。

显微镜测微尺的使用

技术支持

显微测微尺是用来测量标本物体大小、长短的工具。它分为目镜和物镜测微尺两种。目镜测微尺观察到的标本大小，必须通过物镜测微尺测得的数据换算后，才是标本的真实大小。

目镜测微尺是一圆形玻片，内有一把小尺，通常为5mm长，分为50小格。关键是一小格是多少微米。有的是10mm长，分为100小格的型号的，也是一样方法。

物镜测微尺是一特制的载玻片，中央有一小圆圈，圈内有一长度为1mm（1000微米）的小尺，它分为100小格，每小格为10微米。

使用方法：

1、目镜测微尺的校正

将目镜测微尺装入目镜的隔板上，旋下顶端透镜，将目镜测微尺放入（将有刻

度一面朝下），再旋紧顶端透镜并放入筒内。

将物镜测微尺有刻度的一面置于显微镜载物台上。使刻度朝上，对准光源，先用低倍镜观察寻找载物台上的物镜测微尺的刻度，找出后将目镜测微尺与物镜测微尺一端重叠对齐，使目镜测微尺的“0”点与物测微尺的某一刻度重合，即看看目镜测微尺占满物镜测微尺小格数，即可换算出标本究竟大小多少微米。

例如：目镜测微尺50小格占满物镜测微尺68小格（即为680微米），其计算方法是：680微米/目镜50小格=13.6微米，即为目镜测微尺每小格的长度为13.6微米。

注意事项

由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此，校正目测微尺时必须对特定的显微镜和附件进行校正，并且只能在特定的情况下重复使用，当需要更换放大倍数时，必须重新校正目测微尺每一格所代表的长度。

校正完毕后，一般在显微镜手把上标明此镜10×；40×；放大倍数的每小格目镜测微尺所代表的长度。

倒置荧光显微镜及其主要应用领域

技术支持, 未分类

倒置显微镜具有在培养瓶或培养皿内进行显微观察的特点,可以观察不经染色的透明活体 ; 落射荧光显微适用于荧光显微术。该仪器特别适用于对活体细胞和组织、流质、沉淀物等进行显微研究，是生物学，细胞学，肿瘤学，遗传学，免疫学等研究工作的理想仪器。可供科研、高校、医疗、防疫和农牧等部门使用。倒置荧光显微镜是由倒置显微镜和落射荧光显微镜组成。仪器配有长工作距离平场消色差物镜、大视野目镜、双目观察，倒置显微镜还配有特长或超长工作距离聚光镜，同时配有相衬装置及长工作距离平场相衬物镜。

倒置荧光显微镜是近代发展起来的新式荧光显微镜，特点是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。

倒置荧光显微镜由荧光附件与倒置显微镜有机结合构成的，主要用于细胞等活体组织的荧光、相差观察。 倒置显微镜(Inverted microscope)是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。由于这些活体被检物体均放置在培养皿(或培养瓶)中，这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长，能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此，物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来，故称为”倒置显微镜”。倒置显微镜多用于无色透明的活体观察，在倒置显微镜的基础上添加一套荧光附件：激光激发块，荧光光源，荧光照明器，激发块切换装置，即可进行倒置荧光观察。

一、荧光显微镜标本制作要求

1.载玻片

载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

2.盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涩盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本。

3.标本

组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能被充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，影响判断。

4.封裱剂

封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在PH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L PH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

5.镜油

一般用暗视野荧光显微镜和油镜观察标本时，必须使用镜油。最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。

二、荧光显微镜基本操作

1.关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯;

2.根据样品标记的荧光素选择相应的滤光片;

3.放好样品，找到合适的视野;

4.如需拍照，请确认照相机内已装好彩色胶卷(最好使用27定胶卷);

5.开启自拍装置，选择手动档，通常拍摄速度在0.5-10秒内;

6.使用结束，关闭所有电源并做好使用记录。

三、荧光图像的记录方法

荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。

荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片即可。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。

四、使用荧光显微镜的注意事项

1.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

2.应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

3.防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。

4.检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱;标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱;所以，最多不得超过2～3h。

5.荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

6.标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。

7.荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”指无或可见微弱荧光。“+”指仅能见明确可见的荧光。“++”指可见有明亮的荧光。“+++”指可见耀眼的荧光。

普通光学显微镜的使用方法和注意事项

技术支持

1．低倍镜的使用方法

（1）取镜和放置：显微镜平时存放在柜或箱中，用时从柜中取出，右手紧握镜臂，左一手托住镜座,将显微镜放在自己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边1－2寸为宜，便于坐着操作。

（2）对光：用拇指和中指移动旋转器(切忌手持物镜移动)，使低倍镜对准镜台的通光孔(当转动听到碰叩声时，说明物镜光轴已对准镜筒中心)。打开光圈，上升集光器，并将反光镜转向光源，以左眼在目镜上观察(右眼睁开),同时调节反光镜方向，直到视野内的光线均匀明亮为止。

（3）放置玻片标本：取一玻片标本放在镜台上，一定使有盖玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察的部位调到通光孔的正中

（4）调节焦距：以左手按逆时针方向转动粗调节器，使镜台缓慢地上升至物镜距标本片约5毫米处，应注意在上升镜台时，切勿在目镜上观察。一定要从右侧看着镜台上升，以免上升过多，造成镜头或标本片的损坏。然后，两眼同时睁开，用左眼在目镜上观察，左手顺时针方向缓慢转动粗调节器，使镜台缓慢下降，直到视野中出现清晰的物象为止。

如果物象不在视野中心，可调节推片器将其调到中心(注意移动玻片的方向与视野物象移动的方向是相反的)。如果视野内的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的大小来调节，如果在调节焦距时，镜台下降已超过工作距离(>5.40mm)而未见到物象，说明此次操作失败，则应重新操作，切不可心急而盲目地上升镜台

2．高倍镜的使用方法

（1）选好目标：一定要先在低倍镜下把需进一步观察的部位调到中心，同时把物象调节到最清晰的程度，才能进行高倍镜的观察。

（2）转动转换器，调换上高倍镜头，转换高倍镜时转动速度要慢，并从侧面进行观察(防止高倍镜头碰撞玻片)，如高倍镜头碰到玻片，说明低倍镜的焦距没有调好，应重新操作。

（3）调节焦距：转换好高倍镜后，用左眼在目镜上观察，此时一般能见到一个不太清楚的物象，可将细调节器的螺旋逆时针移动约0.5－1圈，即可获得清晰的物象(切勿用粗调节器!)

如果视野的亮度不合适，可用集光器和光圈加以调节，如果需要更换玻片标本时，必须顺时针(切勿转错方向)转动粗调节器使镜台下降，方可取下玻片标本。

3．油镜的使用方法

（1）在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。

（2）将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。

（3）转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。

（4）用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。

如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。

（5）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。

注意事项

• 持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。
• 轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。
• 保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。
• 水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。
• 放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。
• 要养成两眼同时睁开的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。
• 不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。
• 使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写使用登记表。(注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为平放)

复式显微镜的操作

技术支持

复式显微镜一般为单眼观察(比较高级的也有双眼同时观察)，放大倍率较解剖显微镜高很多，甚至于千倍。为研究生物学一项不可或缺的工具。

复式显微镜的原理

复式显微镜的镜头都是采用凸透镜来制造，所以有放大功能；放大倍率是目镜和物镜的乘积。因为光线来源是穿透式的，所以观察的材料要切的薄薄的，让光线穿过，才能进行观察，因此，通常我们必须要先将观察的材料做成切片标本。

 
制作标本的工具

盖玻片

载玻片

滴管

镊子

培养皿

刀片

新鲜标本的制作  (以头发为例)

(1) 取干净的载玻片一片

(2) 滴一滴水(不要太多！)

(3) 梳梳头发，在梳子上找一根掉发。

(4) 将头发放在水滴中央。

(5)盖玻片以45°慢慢盖上，避免产生太多气泡，影响观察。

(6) 如果发现盖玻片会浮动，就是水滴太多了，这时拿一张吸水纸靠在盖玻片旁边，将多余的水分吸掉。

(7) 如果气泡太多影响观察，或者是水太少，可以在盖玻片的一侧滴一滴水，在另一侧放吸水纸将水均匀的吸过去。

(8) 做好的标本若要暂时保存，则可以用指甲油将盖玻片的周围封起来。

新鲜标本的观察

1.把做好的玻片标本放在显微镜镜台的中央，中心点对准镜台中央的圆孔。

2.把玻片两端用玻片夹夹住固定。

3.物镜放入10x，旋转旋转盘，调整为最低倍的物镜(通常是4x)，此时放大倍率是40x。

4.光源：

(a)打开显微镜自己的灯源(若没灯源则调整反光镜的位置)

(b)调整光圈的大小，使光线适中。

(c)若是在高倍率下，可以外加灯照。

5.转动粗调节轮，直到玻片距离物镜约1㎝左右，转动细调节轮，直到看得清楚。

6.练习两眼同时张开，以左眼观察(这样右手可直接画图记录，所以若你是惯用左手，就用右眼观察)

7.在低倍镜下找到要观察的东西后，将要观察的东西移至视野中央。

8.更换高倍物镜观察，稍稍转动细调节轮，使视野清楚，如果换成高倍物镜就看不到所要观察的东西，则换回低倍镜下确定所观察的东西在视野中央。

9.光线太暗的处理：

(a)检查显微镜的灯源有没有开(或是反光镜有没有调好)

(b)光圈的大小

(c)标本是不是切得太厚不透光。

10.头发观察的结果：

标本的染色

1.生物的细胞通常是透明无色的，所以加入染色剂可以让我们观察的更清楚。

2. 常使用的染色剂是碘液和甲基蓝液。

3. 方法一：直接滴加一滴染色剂替代水。

4. 方法二：已做好的标本，则可以在盖玻片的一侧滴一滴染色剂，在另一侧放吸水纸将水均匀的吸过去。

金相材料分析与制样过程

技术支持, 未分类

          用金相显微镜如何观察不同金属组织及缺陷呢，以下这个详细制做过种是初学者们最好的学习参考。

一、 实验的主要目的
1.初步学会金相样品制备的基本方法
2.分析样品制备缺陷及防止措施
3.初步认识金相显微镜下的组织特征
4.学习数码照相技术

二、实验概述

   在要检测的材料或零件上截取样品，取样部位和磨面根据分析要求而定，截取方法视材料硬度选择，尺寸以适宜手握为宜。

最常用的取样方法

  粗磨

检验面整平

倒角

粗砂纸磨制

细磨
在一套不同粒度的砂纸上磨制，由粗到细。

更换砂纸时，磨痕方向与上道垂直，砂粒勿带入下道。

磨向要长、用力匀，样品与砂纸紧密接触

抛光：电解抛光、化学抛光、机械抛光、复合抛光等

抛光材料
抛光粉

抛光布

抛光液、抛光膏等

抛光机使用方法与注意事项
1.开机前，检查并放好抛光布，压布圈、环形盖。
2.按抛光机开关面版上的指示方向，打开开关或按钮，
 抛光盘转动平稳后进行抛光
3.抛光时，头要抬高，以防样品飞出伤人。
4.注意安全。

抛光方法

选择抛光粉
配制抛光溶液，比例大约为10—15%。
打开抛光机开关或按钮，
手握紧样品放在盘半径约一般处抛光。
边抛光边加入少量的抛光液。
注意若抛光液浓度不均匀，振动瓶子，数秒后加入。
一般的材料用Cr203绿粉、帆布粗抛光即可。
特殊样品要用Fe2O3红粉、丝绒细抛光。
样品表面抛好后，光亮如镜，干净干燥可腐蚀。
       否则重抛光或用水冲洗，用酒精冲洗，吹干腐蚀

 
其它磨抛设备
粗磨、细磨、抛光在预磨机、磨抛机上进行。  

预磨机

带具磨抛机

腐蚀：
化学腐蚀
电解腐蚀
恒电位腐蚀等

最常用的为化学腐蚀方法

常用化学腐蚀方法

化学侵蚀操作

腐蚀剂的配制方法

常用腐蚀剂

样品制备过程注意事项

样品制备缺陷

。

怎样用间接法进行免疫荧光细胞化学染色

技术支持

 以下是具体的实验操作步骤：
（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。
（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。
对照染色：
①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。
②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。
③阳性对照。
  间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：
①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。
②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。
⑤如③水洗。
⑥缓冲甘油封固，镜检。
　间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。