光学显微镜对比

当成像标本，在光学显微镜下，在强度和/或颜色差异造成图像对比度，这使得个人的特点和标本的细节变得可见。对比度定义为光照强度之间的形象和相邻的背景，相对的整体背景强度的差异。在一般情况下，最低为0.02（2％）的对比度值是需要由人眼分辨的图像和它的背景之间的差异。对于其他探测器，如电影，视频摄像机，或光电探测器（CCD和CMOS器件），最低的反差往往是一个不同的值。每个探测器，信号信噪比（噪音是所有的光在光学系统没有图像信息的）必须大到足以形成一个连贯的图像的解释。

标本中产生的光的吸收的对比度，亮度，反射，双折射，光散射，衍射，荧光或颜色的变化已经在明显微镜的成像标本的古典意味。映衬或其他邻近的细节一个细节的能力是衡量标本的对比。在一个简单的公式，对比度可以被描述为：

Percent Contrast (C) = ((I(s) – I(b)) × 100)/I(b)

I（b）为背景的强度，I（S）是试样的强度。从这个等式，这是显而易见的标本对比度是指图像中的最高和最低的强度之间的关系。在图1所示的图表显示的背景强度上的对比效果。当背景是一个非常暗灰色（I（B）等于0.01），在图像强度小的变化，产生一个大的变化相反。通过减轻的背景颜色有点浅灰色（I（B）等于0.10），在图像亮度的微小变化，提供一个有用的对比。在较亮的背景颜色（一（b）> 0.20），图像对比度是相对不敏感的背景强度，并在我大的变化（二）只产生小的增加或减少图像对比度。

虽然在现代显微镜发现的光学系统可能生产在高放大倍率的高分辨率图像的能力，这种能力是没有足够的对比度在图像毫无价值。对比度是不是一个试样的固有财产，但依赖于光耦合到探测器可靠地记录图像信息的能力的光学系统的效率与试样相互作用。显微镜的光学系统中的图像对比度控制，取决于几个因素，主要是设置光圈隔膜，在光学系统的像差程度，光学对比系统，标本类型，和光探测器。在显微镜有几个网站，让对比度调整。这些领域的光圈，冷凝器光圈，视频检测器的进一步放大，电子照相机伽玛，电影伽玛，印刷纸伽玛，在实时图像处理，以及标本染色。

因为人眼感知自己的形象产生了对比的对象，可以很容易误入歧途，除非有知识的光学事件发生产生图像的对比度。图2说明了三个相同的视场，含无色透明，人类面颊细胞与不同的对比度模式下的光学显微镜成像显微照片：明，相衬，霍夫曼调制对比度。这是很明显的，出现不同的三个图像，以及由于这些变化，显微镜可能到达每个视场从不同的结论。在图2（a）所示的细胞成像与显微镜操作与冷凝器的光圈在明模式，关闭足以使试样边缘可见。

使用相衬光学面颊细胞相同的视场是在图2（b）所示。注意：黑暗的内心地区和周围的细胞膜和细胞核（所谓的光晕，是文物）如物体的边缘明亮的外地区。这种观点认为，这是困难的指定单元格的边缘，并解释图像中的黑暗与光明的地区的原因。这些细胞也出现相当平坦。最后，在图2（c）所示的细胞成像使用霍夫曼调制对比度，图像的一面是黑暗的，而它的对面是光明的，导致伪三维物体的感知。在图2中，每个视场提供了不同的标本形象，并导致不同的解释，只能显微镜有关如何创建这些图像与知识破译。

在光学显微镜，尤其是未染色或物质生活的许多标本，反差如此之差，该标本仍然基本上是无形的客观能力解决或明确分开的细节。通常情况下，只等标本，重要的是不要改变他们杀害或化学染料或固定剂治疗。这种必要性已导致显微镜，企图以提高试样的知名度并没有改变试样本身带来更详细的图像对比度增强了一百多年的技术实验。它是一种常见的做法，以减少冷凝器光圈下面推荐的大小或降低显微镜台下聚光器，以提高标本的对比。不幸的是，虽然这些演习确实会增加对比度，他们也严重降低分辨率和清晰度。

它之前要考虑如何光与物质相互作用的特点，讨论在光镜下控制对比度的方法是有用的。可能是空间相干，语无伦次，或部分相干光照亮标本负责。例如，可以形光束狭缝或环的形式，可以选定的波长，在各个方向振动垂直传播或在一个单一的方向，由于两极分化的方向组成。

一些标本被认为是振幅的对象，因为它们吸收光线，部分或完全，因此可以很容易使用传统的明视野显微镜观察。其他自然颜色或人工与化学颜色染料染色，也可清楚地用显微镜成像。这些污渍或自然的色彩吸收，白色光通过的某些部分和传输或反映其他颜色。通常情况下，污渍相结合，产生的对比色，如蓝色苏木结合细胞质中的粉红色曙红细胞核染色。它是一种常见的做法，利用标本，不容易吸收光线的污渍，从而使眼可见的图像。

其他标本不吸收光线，被称为相位对象。由于人的眼睛只能检测亮度和颜色的差异，相位的变化由于对象必须被转换成强度的差异。阶段标本的特点是几个标准，包括其形状（通常为圆形或扁），内部光散射元素的密度，厚度，以及独特的化学或电气（统称为折射率分组）的结构特性。厚标本可能是比较明确的，只包含一些光散射元素，或不通过光线，使试样的有效不透明传输照明，它们可能包含很多散射元素。这些标本通常被称为反射光标本。

当考虑的光学方法，以提高标本的对比，这是一个可以操纵的这些特性创造的强度变化，使它们可见的标本中有必要考虑各种特性。一个首要的问题是其中的对象的特点，将独特的设置在很多情况下转化成不同的强度。

标本的细节和边缘，有大小近似将衍射成像光的波长或散射光线，提供有一个之间的标本及其周围介质（环绕声）的折射率的差异。折射率的定义是通过空气或真空中光的速度通过对象分为光的速度比。因为光的速度通过任何材料是小于光在真空中的速度，折射率总是超过1.0用显微镜检查标本价值。为了解决小对象之间的距离，并重现其形状与合理的保真度，大角度的衍射光必须被捕获显微镜物镜。

衍射（或背离）光聚集的目标，必须带入一个大家关注的焦点，在平面图像，以产生标本细节，如在图3所示。在图像平面，组成衍射光的光波经过undiffracted光线的干扰。干扰后的能见度非常依赖一致性照亮标本后，能见度增加按比例增加的一致性。在光学显微镜下，冷凝器的光圈开口大小控制的空间相干光对试样的冲击。减小光圈大小，产生一个更大的空间相干性。

显微镜长期以来依靠降低冷凝器光圈开口尺寸增加阶段标本中的颗粒和边缘的能见度。振幅对象的对比也可以提高冷凝器的孔径适当的调整。小的物体，边缘和粒子将衍射光，不管他们是否属于一个幅度或相位标本。只有这种衍射光的一部分被捕获的目标（见图3）由于客观的数值孔径的限制。剩余不收集的衍射光图像信息丢失。冷凝器光圈开口尺寸正确的设置是一个标本图像对比度增强和引进衍射文物之间的权衡。这些都表现在亏损的分辨率，衍射环的叠加，和其他不良的光学效应的标本中，在共同关注的焦点的地区。由于接近衍射极限，图像对比度降低对象的详细信息变得越来越小，空间频率变大。

井上和弹簧所描述的图像对比度的比值标本的对比，并在实际和理想化的光学传递函数（OTF）当空间频率的函数绘制的正弦形象占领的阵地相移。光从标本中的分布变得正弦的情况下，光学传递函数模成为调制传递函数（MTF）。随着空间频率的增加，调制传递函数的减少和标本的对比减少。

对于每一个目标，具体的调制传递函数依赖的目标设计和数值孔径，对比一代的模式，照明光的波长，和台下冷凝器的数值孔径。作为一个低通滤波器的衍射光，必须在平面图像干扰，集中发生和形成的颗粒或边缘的形象的目标后焦平面的边缘。聚焦显微镜将这些衍射光波在中间的平面图像。光的波前与标本的角度，决定集中的顶部或底部光滑圆润的表面，通常不包含衍射网站的困难程度。但是，球形标本或纤维的边缘很容易集中，因为边缘接口是在波前有足够的角度和衍射光。

在讨论阶段标本时，我们将定义一个对象的任何标本的解析部分。许多对象将持平或片状，如图4所示。在这个数字中，对象有一个厚度（T），折射率，N（S）。周围介质的折射率为n（M）。

标本通过光路的光传播，OP = T（N（S）），并通过光路周围介质，OP = T（N（M））。光程差（OPD）可以表示为：

OPD = (tn(s) – tn(m)) = t(n(s) – n(m))

随着相位差：

δ = (2π/λ)(OPD)

其中π是一个常数（3.14159265），λ是波长照亮标本。光程差的产品两个方面：厚度（T）和折射率（n）的区别。在门诊经常可以相当大，即使对象的厚度相当薄。另一方面，当标本和周围介质的折射率是平等的，门诊是零，即使试样的厚度是非常大的的。在这种情况下，光线穿过对象仅仅是延迟（相位差）相对的光线环绕同等厚度。相位差是无法检测到人眼。

相衬显微镜的设计，采取的一个标本，并在周围介质中的对象之间的相位差优势。但是，它不只是一个阶段的差异，是必要的，但也从试样的衍射必须发生相衬显微镜工作。

一个阶段的对象，最常见的形状是一个不断变化的，如在图5所示的半球形标本，光路或密度。在这种情况下，双方相对象可以由棱镜的形状近似数学，讨论如下。在图5的阶段对象的折射率N（S）和周围介质中，N（M）。相对象的形状激进的几何转换只发生在边缘A和B（见图5（a）条）。入射光的影响对象垂直于AB的平面，而平面波前是平行于AB。

1（在图5（a）四舍五入阶段对象的顶点）的边界基本上是平行的事件眼波的，而在A和B的界限是垂直的。 2至4个区域是由相对象（图5（b））的圆形表面的切线定义的微型棱镜。 “棱镜”的角度在区域2比4地区，这是相反的区域4’较小。在边缘A和B的衍射是最强的。

因此，弯曲的物体组成的多棱镜和两侧的对象棱镜面向相反的方向。最陡的棱镜是在赤道的一个球形的对象，而在位于顶部和底部的坡度用最少的棱镜。这些微型棱镜构成的光学梯度：

OG (Optical Gradient) = Φ = α(n(s) – n(m))

其中，α的切线与平面波前角。请注意，光学梯度是产品两个方面：光通过双方之间的角度（α），折射率（N（S） – N（M））的区别。光线通过棱镜改变方向传递的角度Φ（参见图5（c）和5（D））。方向的变化可能会很大，即使斜坡或边界梯度的可能很小，如果折射率相差较大。如果是相同的折射率，光波通过第一阶段对象unrefracted。退出棱镜光的方向依赖于相对象（N（S））和其周围介质（N（M），参见图5（c）和5（D））之间的折射率的相对差异。

正如我们上面所讨论的，圆润的阶段对象不断变化的光梯度，以及每一个人的光学梯度“棱镜”创建一个光偏转的角度不同。图5（c）说明了当周围介质的折射率大于相对象（N（M）N（S）），和图5（d）时显示的方向却是相反的方向偏转（ N（M）<N（S））。偏转角，Φ，是成正比的切线角（α）和折射率差（N（S） – N（M）），这样：

tan Φ = tan α (n(s) – n(m))

对于小角度：

Φ = α (n(s) – n(m)) (in radians)

要总结的“棱镜”效应的光学梯度界限，当超过周围介质的折射率相对象，每个对象的斜坡上，大小相等的梯度转移在同一角度。偏转角时的相对折射率差和相切的几何角度（α）的依赖。当介质的折射率（N（M））大于对象的折射率（N（S）），偏转是相反时，情况正好相反。当有没有梯度，有没有光的偏转通过。

轻者可通过各种机制进行交互，以生成图像对比度与标本。这些措施包括从表面反射，吸收，折射，偏振，荧光和衍射。对比度也可以增加物理改性显微镜的光学元件和照明模式，以及通过摄影或数字电子技术的最终图像的操纵。下面的讨论中突出的标本和光和评论的光学显微镜技术已经开发，以提高标本的对比之间的各种相互作用。

当入射光罢工一个不透明的表面，它体现的方式是具体的，表面的地形。非常光滑的表面反射光线的一个角等于入射光，称为镜面反射一个机制。表面不均匀或弥漫性往往反映了一个现象称为漫反射所有可能的角度的光线，在进入目标的光量减少。在反射光显微镜的对比度可以提高通过仔细的样品制备。金相样品往往蚀刻反应揭示晶界和/或打磨，以增加反映到显微镜的光量的液体和气体。污点，在形式的荧光染料，薄膜，金属涂料，也可用于引进反射光镜标本的对比。双折射标本，可以使用偏振光反射光的和透明的阶段对象是经常的使用技术，如反映的微分干涉对比，暗场照明，和霍夫曼调制对比观察的成像。

人类的眼睛是非常敏感，在样本的振幅和波长的差异。出于这个原因，许多标本切成薄片（厚度1-30微米不等），并用化学染料染色可以提高对比度，区分标本内的居住结构。这种技术已经相当普遍地使用了数百年的生物标本。染料的选择性吸收一个或几个波长的光，并通过或反映所有其他波长。一个例子是一个蓝色的例外，这是反映通过试样传输，吸收所有可见光波长的蓝色染料。一个生物标本的内部结构元素往往沾有的染料混合物选择性染色这些元素，加强对他们的背景，不同的颜色是透明或染色的材料对比。

这些技术也适用于荧光染料，可用于增加具有高度的特异性，在标本的对比。荧光标本之一波长的可见光或近紫外线光刺激时，他们往往发出的光的波长较长，从而成为可见的，或对比相在外地或背景（图6）其他对象。荧光显微镜技术，在显微镜底漆的另一部分中详细讨论。

增加染色标本的对比早期和目前使用的方法，利用色彩对比过滤器，Wratten漆明胶广场（柯达），或在光路中的干扰滤波器。例如，如果一个标本是一个红色的污点，绿色过滤器会变暗的染色红色区域，从而提高对比度。另一方面，绿色过滤器将减轻任何绿色染区。彩色滤光片是非常有价值的的艾滋病标本的对比，尤其是当黑白显微摄影是我们的目标。绿色过滤器是使用消色差透镜的目标，这是纠正球绿灯，相衬的目标，这是假设使用的绿光，波长操纵设计特别有价值，因为相标本通常是透明和缺乏固有色。

各向异性材料通常表现出两个或两个以上的折射率，因而被称为双折射，或双重折射。其中包括在这一类的标本，矿物，晶体（结构匀称表现出高度的），纤维，毛发，和其它生物标本。当光线进入非光纤（光轴以外的轴）轴各向异性晶体，它是折射到每个偏振光的振动方向彼此成直角为导向，并以不同的速度行驶的两条射线。由此产生的光波是两极化，可能会干扰时，在显微镜分析仪重组产生双折射标本的图像都非常重要，并包含一个显著的对比。

活标本和其他阶段的对象，这往往产生较差的图像，在明照明，是由光而不是化学手段霍夫曼调制相衬，对比和微分干涉对比照明下观察清晰可见。这些技术需要特殊的光学元件，显微镜，但通常会产生足够的对比度的图像，揭示有关标本结构的重要细节。我们的专业显微技术“部分中可以找到一个更深入的讨论，这些对比增强技术。

另一种简单的技术，提高对比度，涉及从标本折射率不同的安装介质的选择。例如，硅藻，可以安装在各种对比增强介质如空气或商业中苏合香。折射率的差异，提高这些无色物体的对比度，呈现其轮廓和标记更为明显。以下各节描述了许多现今显微镜更复杂的技术，以提高标本的对比。

上海光学仪器厂

/ 五十年历史,重铸辉煌 /

/ 上海光学仪器厂介绍 /