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光学显微镜基础知识 – 工作原理

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自从他们在16世纪后期的发明，光学显微镜，加强在基础生物学，生物医学研究，医疗诊断和材料科学的知识。光学显微镜可观察放大高达1000倍的物体，揭示了微观细节。光显微镜技术的发展远远超出罗伯特胡克和安东尼范列文虎克的第一显微镜。已经开发了特殊的技术和光学揭示活细胞的结构和生物化学。显微镜甚至已经进入数字化时代，利用电荷耦合器件（CCD）和数码相机捕获图像。然而，这些先进的显微镜的基本原则是很多像你可能已经在你的第一个生物课的学生显微镜。

在本文中，我们将进入光学显微镜的微小世界和检查，让他们暴露是什么，否则无法检测到人眼的各种技术。

基础知识

光学显微镜的工作方式非常像折射望远镜，但一些细微的差别。让我们简要回顾望远镜是如何工作的。

望远镜必须收集大量光线昏暗，远处的物体，因此，它需要一个大的物镜收集尽可能多的光，并把它带到光明的重点。由于物镜是大的，它带来的一个重点对象的形象，在一定的距离，这是为什么望远镜更长的时间比显微镜。望远镜的目镜放大，图像，因为它带给你的眼睛。

相比之下望远镜，显微镜必须收集从薄，以及照明的标本，是密切由微小的面积。因此，在显微镜并不需要一个大的物镜。相反，在显微镜的物镜，小球形，这意味着它两边的焦距要短得多。它使人们集中在一个短的距离内，在显微镜的管对象的形象。图像放大，第二个镜头，称为目镜或目镜，因为它是你的眼睛。

其他望远镜和显微镜之间的主要区别在于，，显微镜有一个光源和一个冷凝器。冷凝器是一个镜头系统，着重从源到一个微小的，亮点的标本，这是同一地区的物镜检查。

也不像其中有一个固定的物镜和互换目镜，望远镜，显微镜通常有可互换物镜和固定目镜。通过改变物镜（相对平坦，低倍率的目标要全才，高倍率的目标），显微镜可以带来越来越小的领域，进入视野 – 聚光的首要任务，因为它不是在显微镜的物镜，望远镜的。

我们将在本文后面，在显微镜的部分详细介绍。

做一个简单的显微镜

您可以通过一个简单的显微镜下，用放大镜和纸张：

获得两个放大镜和一张印刷纸。

保持一个放大镜以上纸张的短距离。打印图像会显得更大一点点。

将你的眼睛和放大镜之间的第二个放大镜。

移动第二个玻璃或打印，直到成为大家关注的焦点。你会发现，打印出现大于它在第一放大镜。

显微镜教学五 放大倍数和显微测量法

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显微镜之放大倍数之近似值,趋近于接目镜与接物镜放大倍率之乘积,但由于制作时的差异,每一个镜头皆有些许不同的误差。欲得知所观察物体的实际大小,首先在目镜的两镜头之间加装一个目镜测微尺 ( Ocular micrometer )（如图2-1a所示）。在载物台上置一载物台测微尺 ( Stage micrometer ) （如图2-1b所示）,该测微尺为载玻片上刻有一段划分1 mm为100小格的直线,即载物台测微尺上每小格的长度为0.01 mm (10m m )。使用方法为:移动载物台测微尺,使两测微尺之一端刻度重叠成一直线,再检视另一端刻度重叠处,分别计算此一区间内,两测微尺上之格数,则目镜测微尺上每一格长度之计算如下:

（a）

（b）

图2-1 （a）两种不同的目镜测微尺（Ocular micrometer）（b）载物台测微尺（Stage micrometer）

新的数码显微摄像系统

业内新闻

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显微镜教学四 复式光学显微镜的使用方法

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(1) 显微镜的取用

一手握镜臂,一手托住镜座,将显微镜轻轻放置在桌上,距桌缘约一个姆指距离之处.

调整坐椅至适当高度,使自己可以轻松地使用显微镜.

取 95% 酒精及拭镜纸,将所有镜头擦拭干净(※注意:仅能以单一直线方向擦拭).

将玻片标本平稳地放在载物台上,以玻片夹夹好(※注意:请确认是否夹好,以免玻片跳起,造成同学受伤或损及显微镜镜头).

(2) 低倍镜的使用

先将载物台降至最低点,转动旋转盘( Revolving nosepiece ),使低倍镜位于镜筒正下方.

打开光源,调整光源调整钮及光圈( Iris diaphragm ),使视野中之亮度适当.

将所要观察的玻片放在载物台上,以玻片夹夹好,并转动调节钮 ( mechanical stage control knobs ) 以调整玻片位置.转动调节轮 ( Adjustment knob ),至低倍镜与载物台相距约 0.1 cm(或载物台无法再上升)为止.

由接目镜观察,同时以靠向自己的方向缓缓转动调节轮( Adjustment knob ),使载物台下降,直到影像清晰为止.若视野太亮或太暗,皆可调整光源调整钮及光圈( Iris diaphragm ) ,使视野中之亮度适当.

(3) 高倍镜的使用

先使用低倍镜找到欲观察的目标,将该部位调整至视野中央.

重覆 “低倍镜的使用” 方法之A.~D..

(4) 油镜的使用

先使用高倍镜找到欲观察的目标,将该部位调整至视野中央.

将高倍镜转开,加一小滴油镜专用油( immersion oil ) 于所见物像范围的玻片上(即光线照亮的区域),换用100倍接物镜(即 oil immersion objective),小心将油镜浸于油中,重新调整光圈,并缓慢转动调节轮( Adjustment knob ),直到影像清晰为止.

(5) 注意事项

严忌单手提取显微镜.

若须移动显微镜,务必将显微镜提起再放至适当位置,严忌推动显微镜(推动时造成的震动可能会导致显微镜内部零件的松动,切记!!),使用显微镜请务必小心轻放.

使用显微镜时坐椅的高度应适当,观察时更应习惯两眼同时观察,且光圈及光源亮度皆应适当,否则长时间观察时极易感觉疲劳.

转动旋转盘时务必将载物台降至最低点,以免因操作不当而刮伤接目镜之镜头.

标本染色或其他任何操作皆应将玻片取下,操作完成后再放回载物台观察,切勿在载物台上操作,以免染剂或其他液体流入显微镜内部或伤及镜头.

观察完一种材料,欲更换另一种材料时,务必将载物台下降至最低点,换好玻片后再依标准程序重新对焦,切勿直接抽换标本,以免刮伤镜头或玻片标本.

显微镜使用前后皆应以拭镜纸 ( Lens paper ) 及 95% Alcohol清洁所有镜头,擦拭时应沿单一直线方向轻拭,不可旋转磨擦.

擦拭显微镜镜头时只能用拭镜纸 ( Lens paper ),切勿用其他纸张或手指接触镜头.

用毕显微镜应将载物台下降至最低点,并将低倍镜对准载物台中央圆孔处,将电源线卷好,盖上防尘罩,并收入存放柜中.

若长期不使用,应以 Xylene ( Xylol ) 清洁所有镜头.

显微镜教学三 显微镜简述

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人的肉眼由于先天的限制,在25 cm的明视距离下,只能分辨相距 0.2 mm 以上的两点（即解析力 ( resolving power ) 为 0.2 mm）,对于更微小的物体,就必须借助于显微镜。无论是何种显微镜,其主要功能都在于将影像放大 ( magnification ),并增加影像的明暗对比 ( contrast )。

显微镜种类繁多,依其呈像原理大致可以分为光学显微镜和电子显微镜两大类。两者差异如下表所示:

Table 2-4. A 光学显微镜与电子显微镜对比

增加光学显微镜影像的明暗对比的方法很多,例如利用染色法处理样本,或在显微镜上附加特殊装置（例如位相差显微镜 、暗视野显微镜 、干涉显微镜 、偏光显微镜、X光显微镜、萤光显微镜 、紫外光显微镜等）。

本学年同学将使用到的显微镜有双目镜复式光学显微镜 及双目镜解剖显微镜两种,以下将分别介绍其各部位的名称及功能。

(1) 双目镜复式光学显微镜

接目镜 :放大倍率为 10,可因应各人的双眼距离来调整,内安装有目镜测微尺,有些另装有指针,装有目镜测微尺的接目镜上有调节轮,可因应各人焦距来调整。

镜筒 :介于接目镜与接物镜之间。

旋转盘 :接于镜筒下方,通常有四个接孔,可接不同倍数的接物镜,本身可以旋转藉以更换不同倍数的接物镜。

接物镜:有scanning power objective ( 3.2)、low power objective ( 10)、high power objective ( 40)、oil immersion objective ( 100) 四种。

载物台:为放置标本玻片的平台,中央有一圆孔,可供光线通过。我们所使用的载物台为机械式载物台 ,上面有玻片夹及调节钮 ( mechanical stage control knobs ),可固定玻片及调整玻片位置。

集光器 ( Condenser ):位于载物台下方中央,由许多透镜组合而成,用以集合光线,使之投射于标本上。

光圈(虹膜) ( Iris diaphragm ):连接于集光器下方,上有一支调整柄 ( aperture diaphragm control ),可用以调整光圈孔径大小,以调整投射于标本上之光线强弱。

照明器 ( Illuminator ):位于镜座上,内设光源为钨丝灯,直接提供观察所需之光源。

镜臂 ( Arm ):连接镜筒及镜座,并供握取显微镜。

调节轮( Adjustment knob ):位于镜柱两侧,可调整载物台的升降,以供对焦。依顺时钟方向（远离自己身体方向）旋转,则载物台上升,反之则下降（＊注意:此方向有时依机型厂牌不同而异,也有调节轮是调节镜筒之升降者,首次使用时可先缓慢旋转试试看即可确定）。

镜座 ( Base ):显微镜之最底部。其右侧有光源调整钮,可调整照明器内光源亮度;后方接有电源线,有时尚有光源开关。

(2) 双目镜解剖显微镜 (Binocular dissecting microscope) (Stereomicroscope)

接目镜( Eyepiece ):放大倍率为 8( M1A 机型)或10( M3 机型 ),有些的接目镜上有调节轮( M3 机型 ),可因应各人焦距来调整。

镜筒 ( Body tube ):介于接目镜与接物镜之间。

接物镜( Objective ):M1A 机型只有1一种;M3 机型则有6.4、10、40三种,镜筒两侧有切换钮,可切换三种不同倍数的物镜。

调节轮( focusing knob ):位于镜柱两侧,可调整接物镜的升降,以供对焦。依顺时钟方向（远离自己身体方向）旋转,则接物镜上升,反之则下降。

镜柱( Pillar ):连接镜筒及镜座,并供握取显微镜。

照明器 ( Illuminator ):位于镜座上,内设光源为钨丝灯,直接提供观察所需之光源（※注意:由于此光源为热光源,使用时会发热,应避免直接接触照明器,以免烫伤）,开关在电源线上。

镜座 ( Base ):显微镜之最底部。其上有载物台,为一圆盘,有黑白两色,可依需要自行变换。

显微镜教学二 公制单位 —– 采十进位法

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各公制单位的名称及代表意义如下表所示：

Table 2-1. Metric Unit Values & Conversion（长度单位）

Table 2-2. Metric Unit Values & Conversion（重量单位）

Table 2-3. Metric Unit Values & Conversion（体积单位）

同学必须熟练各单位之间的转换,例如:

3.5 cm = 3.5 10-2 m

= 3.5 10-2 106 m m = 3.5 104 m m

转换单位之目的在于避免使用极大或极小之数字。

显微镜教学一

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显微镜观察

微生物顾名思义，就是十分微小的生命体。以人类肉眼是很难看见微生物的外观，更何况是研究其外部型态以及内部构造。因此在微生物学中，使用显微镜的观察十分重要。除了观看微生物的外观之外，许多的测试以及化学作用的呈色结果，都需要依靠显微镜的观察。

学习目标：于本次实验结束后你应该知道

各公制单位之名称、代表数值及各单位间的转换

复式光学显微镜 各部位的名称及功能

解剖显微镜各部位的名称及功能

比较复式光学显微镜及电子显微镜 之间的差异

字母e经过复式光学显微镜转换后之影像

如何计算视野直径及各镜头下之放大倍率

如何计算镜头下各细胞及标本之实际大小

依序写出使用复式光学显微镜观察之步骤

光学显微镜镜头的保养方法

油镜的使用方法及使用之后如何去除镜头及玻片上的油

显微镜的种类及特点

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光学显微镜的认识人的肉眼像一个透镜,可看到物体的原大小,我们称为1倍,或写做1x;一个普通的镜片若可将物体放大为肉眼可见的5倍大,表示此镜片的放大倍数为5,或写做5x.此种镜片被称为简单型显微镜(simp1e microscope)亦即我们日常所称的放大镜.

若结合两片或两片以上的镜片,可增加放大的效率(power of magnification),复式显微镜(compound microscope)即是将一序列的镜片组合起来而制成的;因为它是利用可见光来产生影像,因此又被称为光学显微镜(1ight microscope),我们常用的「显微镜」(microscope)一词即是指复式显微镜或光学显微镜(后者较常被使用),.一个光学显微镜若由2片5x的镜片组合,则其放大倍率为25x(5x*5x=25x).近代的光学显微镜可将镜片随意组合,最大可放大至1000x.

除了放大倍率外,解像力(reso1ving power、或resolution)和对比(contrast)亦会影响影像的清晰度.解像力是指分辨两点最短的距离;例如人类的肉眼在25cm的明视距离下,解像力为200um(=0.2mm),意即当两个小点的距离近到小于200um时,肉眼即无法辨认清楚,此时即须借重放大镜或显微镜.最好的光学显

微镜之解像力为0.2mm,约为人眼的1000倍.若显微镜放大倍率超过1000倍,我们其实只看到模糊的放大影像,并未观察到更微小的构造,所以超过1000倍以上的倍率称为无效放大倍率(empty magnification)

由课本第一章图1-6中,可知生物体大小的比例,也知光学显微镜可用来观察一般的细胞或较大的胞器.兹列举数种常用的光学显微镜,它们可用不同的方法来增加影像的清晰度,其方法有:

明视野(brightfie1d)一一光学显微镜的标准配备,通常用来观察新鲜或活的标本.光线直接穿透过标本而呈像,但不易看到详细构造,若将标本用不同的染剂染色,可增加对比而使影像更清晰.

暗视野(dark field)一一光线经由某一个角度才穿透过标本,因此只能看到散布的光点.

相位差(phase-contrast)一一将标本中不同的密度放大以增强对比,此法常用在活细胞、未染色的细胞或无色素的细胞,例如观察藻类的鞭毛.

干涉(differentia1-interference一contrast,或称Nomarski)–增强标本内密度的差异性.课本中硅藻(图2一I一2)或鸭织草的下表皮(图2一10),即是以此法拍得.

其他另有共轭焦显微镜及立体显微镜.

共轭焦显微镜(confoca1microscope)–利用雷射和特殊的光学做「光学切片」(optica1sediorling),可将欲观察之物体如同切片一般,一层一层的观察和摄影,只有在所选择的很窄的平面焦距深度才有影像,在它的上方或下方皆现出黑色或模糊的景象;将这些结果合并,即为此物体的立体构造.此法可省去切片的工作.

立体显微镜(stereomicroscope)一一它具有内建式的两部显微镜的光学系统,每一个系统由不同的角度以反射光观察不透明的标本,此种显微镜一定要有双筒的目镜,因此所观察的物体可产生三度空间的立体影像.此显微镜亦可用来解剖微小的生物标本,工业上则可用来组合零件,因此又被称为解剖显微镜 (dissecting microscope).

光学显微镜是利用可见光来产生影像,最高解像力也只能为0.2mm,无法满足人类继续探讨生物构造的欲望.1932年,Busch和 Ruska 发明了第一部穿透式子电子显微镜(Transmission e1ectron microscope,简称TEM);标本需做固定、

脱水、包埋、超薄切片和染色等步骤,在TEM下可观察标本内部的超微细构造.

1938年,van Ardenne发明了第一部扫描式电子显微镜(Scanning e1ectronmicroscope,简称SEM,标本需做固定、脱水、临界点干燥和金属离子覆膜等步骤,在SEM下可观察标本表面的微细构造.电子显微镜是以电子束取代光束,它的波长更短,因此解像力亦增加了,可达到0.4nm的解像力,此几乎为光学显微镜的1000倍.

显微镜的种类—切片显微镜

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切片显微镜：也就是一般在学校中所使用的显微镜，因為使用这种显微镜一定要将样本切片之后来观察，而不能直接放到显微镜底下去做实验，和一般宝石用或解剖用的显微镜有很大的区别。

原理：切片显微镜镜头都是採用凸透镜来製造，所以能有放大功能；另一方面，所接受的光源是採取穿透式光源，让光穿过薄薄的切片后进行观察。

各部位功能说明：

目镜、物镜：显微镜中靠近眼睛的镜头，通常目镜愈长的倍率愈小；而对物镜来说，正好和目镜的特点都相反，目镜愈长，所得的倍率愈大；要如何的计算显微镜的倍率呢？将目镜和物镜上的倍率数目相乘，所得的乘积，就是放大倍率。

调节轮：调整焦距的主要构造，现今的设备都将粗调节轮与细调节轮製作成同轴调节论，外轮為粗轮，内轮為细轮。

微距调整器：能够平顺缓慢的移动玻片，帮助追踪样本。

光源：替代阳光的光线，能够在任何时间进行观察。

物镜旋转盘：更换接物镜的镜筒以对準样本。

照相机接头：能够添加照相机或是摄影机的特别构造。