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光学显微镜基础知识 – 荧光显微镜

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荧光显微镜

显微镜的光学通路

在荧光显微镜采用了汞或氙气灯产生紫外线。光线进入显微镜并碰到分色镜 – 一面镜子，反映了一个波长范围，并允许通过另一个范围。分色镜标本反映了紫外线。标本中的分子内的紫外线激发荧光。物镜收集荧光波长的光产生。这种荧光灯通过分色镜和屏障过滤器（消除波长比荧光灯），使得它的目镜，以形成图像。

标本内的荧光分子可以自然发生，或推出。例如，您可以与钙黄绿素/ AM染料染色的细胞。就其本身而言，这种染料是没有荧光。分子的AM部分隐藏的钙黄绿素分子结合的钙，这是荧光灯的一部分。当你混合的钙黄绿素/ AM与洗澡细胞的解决方案，染料进入细胞穿过。活细胞的一种酶，消除了AM部分，陷阱细胞内的钙黄绿素和允许的钙黄绿素结合钙，所以它在紫外线照射下发出荧光绿色。死细胞，不再有这种酶。因此，活细胞荧光绿色，和死亡的细胞不会发出荧光。你可以看到在同一标本的死细胞，如果你在另一个称为碘化丙啶染料，只渗透死细胞混合。碘化丙啶结合到DNA在细胞核和红色荧光紫外线照射下。这双染技术在毒理学研究中使用，以确定一些环境化学处理，如农药，被杀害，当一个细胞人口的百分之。

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培养的大鼠脑细胞的荧光图像。活细胞染色与钙黄绿素（左）和死细胞染色，碘化丙啶（右）。

荧光显微镜技术，看到结构和测量在活细胞中的生理生化事件。各种荧光指标是可以研究许多重要生理作用的化学物质，如DNA，钙，镁，钠，pH值和酶。此外，特有的各种生物分子的抗体，可以通过化学方法绑定到荧光分子和用于染色细胞内特定的结构。分子表达式：荧光显微镜的详细信息和更多的例子。

在下一节，我们将研究光学显微镜及其功能的组件。

荧光灯:一种光学荧光显微镜物镜是用来把重点放在试样紫外线和搜集标本的荧光灯。比传输荧光，其中一个单独的镜头或冷凝器是把重点放在试样紫外线更有效。还允许另一种类型在同一显微镜结合荧光显微镜。

光学显微镜基础知识 – 光学显微镜的组成部件

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无论是一个简单的学生显微镜或一个复杂的研究显微镜，光学显微镜具有以下基本制度：

控制标本 – 保存和操作试样阶段 – 试样在于剪辑 – 举行试样阶段（还是因为你是在寻找一个放大的图像，甚至试样的最小变动可以将图像的某些部分出 – 你的视野）显微设备，让您移动控制，沿X和Y轴的小增量的标本（用于扫描幻灯片）

照明 – 阐明标本（最简单的照明系统，是一面镜子，反映室内光线通过标本。）灯 – 产生光（通常情况下，灯钨灯丝灯泡专门的应用，汞或氙气灯。变阻器。用来产生紫外线，甚至有些显微镜使用激光扫描标本） – 改变灯控制产生的光冷凝器的强度的电流 – 镜头系统将集中到灯的光标本隔膜或针孔孔径 – 放置在光路改变的光量，到达冷凝器（图像增强反差）一个典型的学生光镜下图，显示的部件和光路

镜头 – 形成图像物镜 – 集光从标本目镜 – 传输和放大的图像从物镜到你的眼睛物镜转换器 – 旋转贴装，拥有许多物镜管 – 保存在适当的距离物镜，目镜，阻挡了杂散光

焦点 – 在适当的距离从标本粗调焦旋钮的位置物镜 – 用来将进入精细调焦旋钮物镜焦平面的对象 – 用来进行微调聚焦影像

支持和对齐ARM – 弯曲部分保存在一个固定的距离光学部件，并将他们的基地 – 支持显微镜部件机架和小齿轮的方式管连接显微镜臂的重量。这个系统可让您更换镜头或观察员时，移动镜头远离舞台变化的标本时，对焦图像。

上面提到的一些部件图所示差异显微镜。显微镜来在两个基本配置：一身正气，倒。在图中显示的显微镜是一个堂堂正正的显微镜，它具有以下的阶段，在舞台上空的镜头系统，照明系统。倒置显微镜，舞台上方的照明系统和台下的镜头系统。通过厚的标本，如培养细胞的菜肴，是因为镜片上可以得到接近底部的菜，细胞生长，倒置显微镜更好。

光学显微镜可以揭示活细胞和组织结构，以及非生物样本，如岩石和半导体。显微镜，可以简单或复杂的设计，和一些可以做多个类型的显微镜，其中每个显示略有不同的信息。光镜下极大地推进我们的生物医学知识，并继续成为一个科学家的强大工具。

光学显微镜基础知识 – 光学显微术的种类

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在显微镜下观察标本的一个主要问题是自己的形象没有太大的反差。这是生活的东西（如细胞）尤其如此，尽管天然色素，如绿叶，可以提供良好的对比度。提高对比度的方法之一是治疗用彩色颜料或染料结合特定结构的标本的标本。已经开发了不同类型的显微镜，以改善在标本的对比。该专业主要是在照明系统和标本通过光的类型。例如，暗视野显微镜使用一种特殊的冷凝器来阻挡最明亮的光线和斜光照亮标本，很像月球块从日食的太阳光线。这种光的设置提供了一个完全黑暗的背景，提高形象，带出精致的细节对比 – 在明亮的区域界限内标本。

图:一个相衬显微镜的光路设计

下面是光学显微镜技术的种类：

明视场,明场 – 这是基本的显微镜配置（迄今看到的图像是从明场显微镜）。这种技术已经非常小的反差;到目前为止，你看到的图像，对比度已被染色的标本提供。

暗视场/暗场 – 此配置提高对比度，如上所述。分子表达式：暗场显微镜的细节和例子。

莱茵照明 – 这个设置是类似暗场，但使用了一系列的过滤器产生的”光染色”的标本。分子表达式：莱茵照明细节和例子。

以下技术作为莱茵照明使用相同的基本原则，实现不同的结果，使用不同的光学元件。其基本思路包括分裂成两个途径的光束，照亮标本。内通过试样，通过密集结构的光波减慢，相比那些通过较密集的结构传递。由于所有光波的收集和传输到目镜，他们重组，使他们互相干扰。干扰模式提供了对比：他们可能会显示浅色背景的暗区（更加密集）（密度较小），或创建一个虚假的三维（3 – D）图像类型。

相衬 – 这种技术是最好的活标本，如培养细胞。

在相差显微镜，物镜和聚光环环单独的光线。的光，通过光路的中央部分，通过重组与光试样的边缘周围旅行。这两条路径产生的干扰会产生致密的结构出现在其中比背景暗的图像。分子表达式：相显微镜细节和例子。

微分干涉对比（DIC） – DIC的使用偏光滤镜和棱镜的光路分离和重组，让一个3 – D的外观标本（DIC是后该名男子是谁发明了它也被称为Nomarski）。分子表达式：微分干涉对比显微镜细节和例子。

霍夫曼调制的对比 – 霍夫曼调制对比的是类似于DIC的，除非它使用小狭缝板在轴和离轴光路产生两套光波穿过标本。同样，一个3 – D图像形成。分子表达式：霍夫曼调制相差显微镜细节和例子。

偏振 – 偏振光光镜下使用两个偏振片，标本两侧，垂直于对方，所以，唯一的光线通过标本通过到达目镜。灯是在一个平面偏振光，它穿过第一个过滤器，达到标本。定期间距，图案或试样的结晶部分旋转的光线穿过。通过第二个偏光镜通过这个旋转灯，使这些规则排列的领域显示明亮的黑色背景。分子表达式：偏光光学显微镜的细节和例子。

荧光 – 这种类型的显微镜使用高能量，短的波长的光（通常是紫外线）激发标本内的某些分子内的电子，导致这些电子转移到更高的轨道。当他们回落到原来的能量水平，他们发出能量较低，波长较长的光（通常是在可见光谱），从而形成图像。

在下一节，我们将讨论更详细的荧光显微镜。

试样制备

透射光观察标本时，光线必须穿过标本，以形成一个图像。试样较厚，光线穿过。穿过的光线就越少，图像越暗。因此，标本必须薄（0.1至0.5毫米）。许多活标本必须切成薄片前观察。标本的岩石或半导体太厚切片和透射光观察，所以他们反映其表面的光线观察。

光学显微镜基础知识 – 图像质量

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当您在使用显微镜标本的时候，你看到的图像质量评估情况如下：

花粉粒的图像亮度好（左）和亮度较差（右）

亮度 – 亮或暗的形象如何？亮度是相关的照明系统，可通过改变电压的灯（变阻器）和调整冷凝器和隔膜/针孔光圈改变。亮度也与数值孔径的物镜（数值孔径较大，则图像越亮）。

花粉粒图片对焦（左）和重点（右）

焦点 – 图像模糊或明确界定的？重点是与焦距和重点旋钮可以控制。标本幻灯片上的玻璃盖的厚度也可以影响你的能力为重点的形象 – 它可以是过于厚物镜。物镜侧面写上正确的盖板玻璃厚度。

具有良好的分辨率（左）和分辨率较差（右）的花粉粒图像

分辨率 – 如何关闭可以在图像中的两个点才不再作为两个独立的点呢？分辨率与数值孔径的物镜（数值孔径更高，更好的分辨率）和波长的光线通过镜头（波长越短，分辨率越好）。

花粉粒具有良好的对比（左）和对比度差的图像（右）

对比度 – 照明标本邻近地区之间的差异是什么？对比相关的照明系统，可通过改变光的强度和隔膜/针孔光圈调整。此外，适用于试样的化学污渍可以增强对比度。

在下一节，我们将讨论不同类型的显微镜。

光学显微镜基础知识 – 工作原理

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自从他们在16世纪后期的发明，光学显微镜，加强在基础生物学，生物医学研究，医疗诊断和材料科学的知识。光学显微镜可观察放大高达1000倍的物体，揭示了微观细节。光显微镜技术的发展远远超出罗伯特胡克和安东尼范列文虎克的第一显微镜。已经开发了特殊的技术和光学揭示活细胞的结构和生物化学。显微镜甚至已经进入数字化时代，利用电荷耦合器件（CCD）和数码相机捕获图像。然而，这些先进的显微镜的基本原则是很多像你可能已经在你的第一个生物课的学生显微镜。

在本文中，我们将进入光学显微镜的微小世界和检查，让他们暴露是什么，否则无法检测到人眼的各种技术。

基础知识

光学显微镜的工作方式非常像折射望远镜，但一些细微的差别。让我们简要回顾望远镜是如何工作的。

望远镜必须收集大量光线昏暗，远处的物体，因此，它需要一个大的物镜收集尽可能多的光，并把它带到光明的重点。由于物镜是大的，它带来的一个重点对象的形象，在一定的距离，这是为什么望远镜更长的时间比显微镜。望远镜的目镜放大，图像，因为它带给你的眼睛。

相比之下望远镜，显微镜必须收集从薄，以及照明的标本，是密切由微小的面积。因此，在显微镜并不需要一个大的物镜。相反，在显微镜的物镜，小球形，这意味着它两边的焦距要短得多。它使人们集中在一个短的距离内，在显微镜的管对象的形象。图像放大，第二个镜头，称为目镜或目镜，因为它是你的眼睛。

其他望远镜和显微镜之间的主要区别在于，，显微镜有一个光源和一个冷凝器。冷凝器是一个镜头系统，着重从源到一个微小的，亮点的标本，这是同一地区的物镜检查。

也不像其中有一个固定的物镜和互换目镜，望远镜，显微镜通常有可互换物镜和固定目镜。通过改变物镜（相对平坦，低倍率的目标要全才，高倍率的目标），显微镜可以带来越来越小的领域，进入视野 – 聚光的首要任务，因为它不是在显微镜的物镜，望远镜的。

我们将在本文后面，在显微镜的部分详细介绍。

做一个简单的显微镜

您可以通过一个简单的显微镜下，用放大镜和纸张：

获得两个放大镜和一张印刷纸。

保持一个放大镜以上纸张的短距离。打印图像会显得更大一点点。

将你的眼睛和放大镜之间的第二个放大镜。

移动第二个玻璃或打印，直到成为大家关注的焦点。你会发现，打印出现大于它在第一放大镜。

光学显微镜对比

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当成像标本，在光学显微镜下，在强度和/或颜色差异造成图像对比度，这使得个人的特点和标本的细节变得可见。对比度定义为光照强度之间的形象和相邻的背景，相对的整体背景强度的差异。在一般情况下，最低为0.02（2％）的对比度值是需要由人眼分辨的图像和它的背景之间的差异。对于其他探测器，如电影，视频摄像机，或光电探测器（CCD和CMOS器件），最低的反差往往是一个不同的值。每个探测器，信号信噪比（噪音是所有的光在光学系统没有图像信息的）必须大到足以形成一个连贯的图像的解释。

标本中产生的光的吸收的对比度，亮度，反射，双折射，光散射，衍射，荧光或颜色的变化已经在明显微镜的成像标本的古典意味。映衬或其他邻近的细节一个细节的能力是衡量标本的对比。在一个简单的公式，对比度可以被描述为：

Percent Contrast (C) = ((I(s) – I(b)) × 100)/I(b)

I（b）为背景的强度，I（S）是试样的强度。从这个等式，这是显而易见的标本对比度是指图像中的最高和最低的强度之间的关系。在图1所示的图表显示的背景强度上的对比效果。当背景是一个非常暗灰色（I（B）等于0.01），在图像强度小的变化，产生一个大的变化相反。通过减轻的背景颜色有点浅灰色（I（B）等于0.10），在图像亮度的微小变化，提供一个有用的对比。在较亮的背景颜色（一（b）> 0.20），图像对比度是相对不敏感的背景强度，并在我大的变化（二）只产生小的增加或减少图像对比度。

虽然在现代显微镜发现的光学系统可能生产在高放大倍率的高分辨率图像的能力，这种能力是没有足够的对比度在图像毫无价值。对比度是不是一个试样的固有财产，但依赖于光耦合到探测器可靠地记录图像信息的能力的光学系统的效率与试样相互作用。显微镜的光学系统中的图像对比度控制，取决于几个因素，主要是设置光圈隔膜，在光学系统的像差程度，光学对比系统，标本类型，和光探测器。在显微镜有几个网站，让对比度调整。这些领域的光圈，冷凝器光圈，视频检测器的进一步放大，电子照相机伽玛，电影伽玛，印刷纸伽玛，在实时图像处理，以及标本染色。

因为人眼感知自己的形象产生了对比的对象，可以很容易误入歧途，除非有知识的光学事件发生产生图像的对比度。图2说明了三个相同的视场，含无色透明，人类面颊细胞与不同的对比度模式下的光学显微镜成像显微照片：明，相衬，霍夫曼调制对比度。这是很明显的，出现不同的三个图像，以及由于这些变化，显微镜可能到达每个视场从不同的结论。在图2（a）所示的细胞成像与显微镜操作与冷凝器的光圈在明模式，关闭足以使试样边缘可见。

使用相衬光学面颊细胞相同的视场是在图2（b）所示。注意：黑暗的内心地区和周围的细胞膜和细胞核（所谓的光晕，是文物）如物体的边缘明亮的外地区。这种观点认为，这是困难的指定单元格的边缘，并解释图像中的黑暗与光明的地区的原因。这些细胞也出现相当平坦。最后，在图2（c）所示的细胞成像使用霍夫曼调制对比度，图像的一面是黑暗的，而它的对面是光明的，导致伪三维物体的感知。在图2中，每个视场提供了不同的标本形象，并导致不同的解释，只能显微镜有关如何创建这些图像与知识破译。

在光学显微镜，尤其是未染色或物质生活的许多标本，反差如此之差，该标本仍然基本上是无形的客观能力解决或明确分开的细节。通常情况下，只等标本，重要的是不要改变他们杀害或化学染料或固定剂治疗。这种必要性已导致显微镜，企图以提高试样的知名度并没有改变试样本身带来更详细的图像对比度增强了一百多年的技术实验。它是一种常见的做法，以减少冷凝器光圈下面推荐的大小或降低显微镜台下聚光器，以提高标本的对比。不幸的是，虽然这些演习确实会增加对比度，他们也严重降低分辨率和清晰度。

它之前要考虑如何光与物质相互作用的特点，讨论在光镜下控制对比度的方法是有用的。可能是空间相干，语无伦次，或部分相干光照亮标本负责。例如，可以形光束狭缝或环的形式，可以选定的波长，在各个方向振动垂直传播或在一个单一的方向，由于两极分化的方向组成。

一些标本被认为是振幅的对象，因为它们吸收光线，部分或完全，因此可以很容易使用传统的明视野显微镜观察。其他自然颜色或人工与化学颜色染料染色，也可清楚地用显微镜成像。这些污渍或自然的色彩吸收，白色光通过的某些部分和传输或反映其他颜色。通常情况下，污渍相结合，产生的对比色，如蓝色苏木结合细胞质中的粉红色曙红细胞核染色。它是一种常见的做法，利用标本，不容易吸收光线的污渍，从而使眼可见的图像。

其他标本不吸收光线，被称为相位对象。由于人的眼睛只能检测亮度和颜色的差异，相位的变化由于对象必须被转换成强度的差异。阶段标本的特点是几个标准，包括其形状（通常为圆形或扁），内部光散射元素的密度，厚度，以及独特的化学或电气（统称为折射率分组）的结构特性。厚标本可能是比较明确的，只包含一些光散射元素，或不通过光线，使试样的有效不透明传输照明，它们可能包含很多散射元素。这些标本通常被称为反射光标本。

当考虑的光学方法，以提高标本的对比，这是一个可以操纵的这些特性创造的强度变化，使它们可见的标本中有必要考虑各种特性。一个首要的问题是其中的对象的特点，将独特的设置在很多情况下转化成不同的强度。

标本的细节和边缘，有大小近似将衍射成像光的波长或散射光线，提供有一个之间的标本及其周围介质（环绕声）的折射率的差异。折射率的定义是通过空气或真空中光的速度通过​​对象分为光的速度比。因为光的速度通过​​任何材料是小于光在真空中的速度，折射率总是超过1.0用显微镜检查标本价值。为了解决小对象之间的距离，并重现其形状与合理的保真度，大角度的衍射光必须被捕获显微镜物镜。

衍射（或背离）光聚集的目标，必须带入一个大家关注的焦点，在平面图像，以产生标本细节，如在图3所示。在图像平面，组成衍射光的光波经过undiffracted光线的干扰。干扰后的能见度非常依赖一致性照亮标本后，能见度增加按比例增加的一致性。在光学显微镜下，冷凝器的光圈开口大小控制的空间相干光对试样的冲击。减小光圈大小，产生一个更大的空间相干性。

显微镜长期以来依靠降低冷凝器光圈开口尺寸增加阶段标本中的颗粒和边缘的能见度。振幅对象的对比也可以提高冷凝器的孔径适当的调整。小的物体，边缘和粒子将衍射光，不管他们是否属于一个幅度或相位标本。只有这种衍射光的一部分被捕获的目标（见图3）由于客观的数值孔径的限制。剩余不收集的衍射光图像信息丢失。冷凝器光圈开口尺寸正确的设置是一个标本图像对比度增强和引进衍射文物之间的权衡。这些都表现在亏损的分辨率，衍射环的叠加，和其他不良的光学效应的标本中，在共同关注的焦点的地区。由于接近衍射极限，图像对比度降低对象的详细信息变得越来越小，空间频率变大。

井上和弹簧所描述的图像对比度的比值标本的对比，并在实际和理想化的光学传递函数（OTF）当空间频率的函数绘制的正弦形象占领的阵地相移。光从标本中的分布变得正弦的情况下，光学传递函数模成为调制传递函数（MTF）。随着空间频率的增加，调制传递函数的减少和标本的对比减少。

对于每一个目标，具体的调制传递函数依赖的目标设计和数值孔径，对比一代的模式，照明光的波长，和台下冷凝器的数值孔径。作为一个低通滤波器的衍射光，必须在平面图像干扰，集中发生和形成的颗粒或边缘的形象的目标后焦平面的边缘。聚焦显微镜将这些衍射光波在中间的平面图像。光的波前与标本的角度，决定集中的顶部或底部光滑圆润的表面，通常不包含衍射网站的困难程度。但是，球形标本或纤维的边缘很容易集中，因为边缘接口是在波前有足够的角度和衍射光。

在讨论阶段标本时，我们将定义一个对象的任何标本的解析部分。许多对象将持平或片状，如图4所示。在这个数字中，对象有一个厚度（T），折射率，N（S）。周围介质的折射率为n（M）。

标本通过光路的光传播，OP = T（N（S）），并通过光路周围介质，OP = T（N（M））。光程差（OPD）可以表示为：

OPD = (tn(s) – tn(m)) = t(n(s) – n(m))

随着相位差：

δ = (2π/λ)(OPD)

其中π是一个常数（3.14159265），λ是波长照亮标本。光程差的产品两个方面：厚度（T）和折射率（n）的区别。在门诊经常可以相当大，即使对象的厚度相当薄。另一方面，当标本和周围介质的折射率是平等的，门诊是零，即使试样的厚度是非常大的的。在这种情况下，光线穿过对象仅仅是延迟（相位差）相对的光线环绕同等厚度。相位差是无法检测到人眼。

相衬显微镜的设计，采取的一个标本，并在周围介质中的对象之间的相位差优势。但是，它不只是一个阶段的差异，是必要的，但也从试样的衍射必须发生相衬显微镜工作。

一个阶段的对象，最常见的形状是一个不断变化的，如在图5所示的半球形标本，光路或密度。在这种情况下，双方相对象可以由棱镜的形状近似数学，讨论如下。在图5的阶段对象的折射率N（S）和周围介质中，N（M）。相对象的形状激进的几何转换只发生在边缘A和B（见图5（a）条）。入射光的影响对象垂直于AB的平面，而平面波前是平行于AB。

1（在图5（a）四舍五入阶段对象的顶点）的边界基本上是平行的事件眼波的，而在A和B的界限是垂直的。 2至4个区域是由相对象（图5（b））的圆形表面的切线定义的微型棱镜。 “棱镜”的角度在区域2比4地区，这是相反的区域4’较小。在边缘A和B的衍射是最强的。

因此，弯曲的物体组成的多棱镜和两侧的对象棱镜面向相反的方向。最陡的棱镜是在赤道的一个球形的对象，而在位于顶部和底部的坡度用最少的棱镜。这些微型棱镜构成的光学梯度：

OG (Optical Gradient) = Φ = α(n(s) – n(m))

其中，α的切线与平面波前角。请注意，光学梯度是产品两个方面：光通过双方之间的角度（α），折射率（N（S） – N（M））的区别。光线通过棱镜改变方向传递的角度Φ（参见图5（c）和5（D））。方向的变化可能会很大，即使斜坡或边界梯度的可能很小，如果折射率相差较大。如果是相同的折射率，光波通过第一阶段对象unrefracted。退出棱镜光的方向依赖于相对象（N（S））和其周围介质（N（M），参见图5（c）和5（D））之间的折射率的相对差异。

正如我们上面所讨论的，圆润的阶段对象不断变化的光梯度，以及每一个人的光学梯度“棱镜”创建一个光偏转的角度不同。图5（c）说明了当周围介质的折射率大于相对象（N（M）N（S）），和图5（d）时显示的方向却是相反的方向偏转（ N（M）<N（S））。偏转角，Φ，是成正比的切线角（α）和折射率差（N（S） – N（M）），这样：

tan Φ = tan α (n(s) – n(m))

对于小角度：

Φ = α (n(s) – n(m)) (in radians)

要总结的“棱镜”效应的光学梯度界限，当超过周围介质的折射率相对象，每个对象的斜坡上，大小相等的梯度转移在同一角度。偏转角时的相对折射率差和相切的几何角度（α）的依赖。当介质的折射率（N（M））大于对象的折射率（N（S）），偏转是相反时，情况正好相反。当有没有梯度，有没有光的偏转通过。

轻者可通过各种机制进行交互，以生成图像对比度与标本。这些措施包括从表面反射，吸收，折射，偏振，荧光和衍射。对比度也可以增加物理改性显微镜的光学元件和照明模式，以及通过摄影或数字电子技术的最终图像的操纵。下面的讨论中突出的标本和光和评论的光学显微镜技术已经开发，以提高标本的对比之间的各种相互作用。

当入射光罢工一个不透明的表面，它体现的方式是具体的，表面的地形。非常光滑的表面反射光线的一个角等于入射光，称为镜面反射一个机制。表面不均匀或弥漫性往往反映了一个现象称为漫反射所有可能的角度的光线，在进入目标的光量减少。在反射光显微镜的对比度可以提高通过仔细的样品制备。金相样品往往蚀​​刻反应揭示晶界和/或打磨，以增加反映到显微镜的光量的液体和气体。污点，在形式的荧光染料，薄膜，金属涂料，也可用于引进反射光镜标本的对比。双折射标本，可以使用偏振光反射光的和透明的阶段对象是经常的使用技术，如反映的微分干涉对比，暗场照明，和霍夫曼调制对比观察的成像。

人类的眼睛是非常敏感，在样本的振幅和波长的差异。出于这个原因，许多标本切成薄片（厚度1-30微米不等），并用化学染料染色可以提高对比度，区分标本内的居住结构。这种技术已经相当普遍地使用了数百年的生物标本。染料的选择性吸收一个或几个波长的光，并通过或反映所有其他波长。一个例子是一个蓝色的例外，这是反映通过试样传输，吸收所有可见光波长的蓝色染料。一个生物标本的内部结构元素往往沾有的染料混合物选择性染色这些元素，加强对他们的背景，不同的颜色是透明或染色的材料对比。

这些技术也适用于荧光染料，可用于增加具有高度的特异性，在标本的对比。荧光标本之一波长的可见光或近紫外线光刺激时，他们往往发出的光的波长较长，从而成为可见的，或对比相在外地或背景（图6）其他对象。荧光显微镜技术，在显微镜底漆的另一部分中详细讨论。

增加染色标本的对比早期和目前使用的方法，利用色彩对比过滤器，Wratten漆明胶广场（柯达），或在光路中的干扰滤波器。例如，如果一个标本是一个红色的污点，绿色过滤器会变暗的染色红色区域，从而提高对比度。另一方面，绿色过滤器将减轻任何绿色染区。彩色滤光片是非常有价值的的艾滋病标本的对比，尤其是当黑白显微摄影是我们的目标。绿色过滤器是使用消色差透镜的目标，这是纠正球绿灯，相衬的目标，这是假设使用的绿光，波长操纵设计特别有价值，因为相标本通常是透明和缺乏固有色。

各向异性材料通常表现出两个或两个以上的折射率，因而被称为双折射，或双重折射。其中包括在这一类的标本，矿物，晶体（结构匀称表现出高度的），纤维，毛发，和其它生物标本。当光线进入非光纤（光轴以外的轴）轴各向异性晶体，它是折射到每个偏振光的振动方向彼此成直角为导向，并以不同的速度行驶的两条射线。由此产生的光波是两极化，可能会干扰时，在显微镜分析仪重组产生双折射标本的图像都非常重要，并包含一个显著的对比。

活标本和其他阶段的对象，这往往产生较差的图像，在明照明，是由光而不是化学手段霍夫曼调制相衬，对比和微分干涉对比照明下观察清晰可见。这些技术需要特殊的光学元件，显微镜，但通常会产生足够的对比度的图像，揭示有关标本结构的重要细节。我们的专业显微技术“部分中可以找到一个更深入的讨论，这些对比增强技术。

另一种简单的技术，提高对比度，涉及从标本折射率不同的安装介质的选择。例如，硅藻，可以安装在各种对比增强介质如空气或商业中苏合香。折射率的差异，提高这些无色物体的对比度，呈现其轮廓和标记更为明显。以下各节描述了许多现今显微镜更复杂的技术，以提高标本的对比。

光学显微术

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光镜下，所谓的，由于它采取可见光检测小的物体，可能是生物学中最著名的和使用的研讨工具。然而，很多学生和老师都不知情的全方位功效，在光学显微镜。由于仪器的本钱增添，其质量和多功效性的最好工具，遗憾的是，不可用的大多数学术课程。然而，即使是最便宜的“学生”显微镜可以供给大自然的壮观风景，可以使学生进行一些相当庞杂的试验。

初学者往往以为观看小物件的挑衅在于获得足够的倍率。事实上，当它面临的最大挑衅是在生活的显微镜，为了寻找，

获得足够的对照度

寻找焦平面

取得了良好的决定案

认识到这个问题，当人们看到它

最小的对象被以为是生涯的细菌。最小的细菌，可以察看到细胞的外形确认，在短短的100倍的放大倍率。他们是无形的，但在明视场显微镜。这些页面将描写用来获取相比之下，标本，并重视对他们的建议，并建议使用光学显微镜丈量装备的光学类型。

光学显微镜的种类

明亮的视野显微镜是最著名的学生是最有可能被发现在课堂上的。可能有更好的设备的教室和试验室的暗场和/或相衬光学。微分干预对比，Nomarski，霍夫曼调制对比度和变更发生相当的深度，分辩​​率和立体后果。荧光和共聚焦显微镜的专用仪器，用于研讨，临床，和产业利用。

比其他复合式显微镜，一个简略的仪器应用低倍率也可能在试验室中被发明。立体显微镜，解剖显微镜通常有双目镜筒，长工作间隔，和范畴的放大倍率通常是从5倍到35或40倍。有些仪器供给更高的放大倍率的镜头，但决定没有改良。这种“虚伪放大倍率”是很少值得就义。

明视场显微镜

随着传统的明视野显微镜，光从白炽灯源的目标是走向舞台下方的镜头称为冷凝器，通过标本，通过客观的镜头，并通过第二个放大镜，眼或目镜眼。我们看到在光路中的对象，因为自然色素冷静或污渍接收光线的差别，或者由于他们是厚到足以接收大批的光，尽管被无色。一个草履虫应显示在明亮的视野显微镜相当不错，固然它并不轻易看到纤毛或大部分细胞器。生涯的细菌不会显示在所有观众命中，除非靠运气焦平面和曲解使用最大比较度的图像。

质量好显微镜有一个内置照明灯，可调光圈（对照度）把持，机械舞台，和双目镜筒冷凝器。冷凝器是通过一个开放的舞台，把重点放在标本。穿过试样后，一个显明的领域是远大于面积照明，光显示的眼睛。图像的放大倍率是物镜的放大倍率（通常是镜头上的机构盖章）倍的目镜放大倍率。

学生通常使用的粗，细的聚焦旋钮，用来加强标本的形象。他们经常不知道调整到冷凝器，可以影响辨别率和对比度。有些冷凝器固定地位，其他人可聚焦，使光的质量可以调节。通常一个可聚焦冷凝器的最佳地位是尽可能接近的阶段。明亮的范畴冷凝器通常包括光圈，装备把持的光的光束通过冷凝器直径，这样，当隔膜才停了下来（近封闭）光直线上升，通过聚光镜中心和对照度高。当隔膜是敞开的图像亮度和对比度低。

单靠一个对比光圈的毛病是超越一个最佳点多比较发生扭曲的形象。用一个小的，未染色，unpigmented的标本中，您通常过往最佳的对比度，当你开端看到的图像。

使用明场显微镜

首先，想想你想要做什么用显微镜。什么是您须要的最大放大倍率？你在寻找染色标本吗？你需要多少的对比/辨别率？接下来，开端设立观看。

安装在舞台上的标本

如果有一个盖玻片必需。高放大倍率的物镜无法集中精神通过厚厚的玻璃幻灯片;他们必须提请封闭的标本，这就是为什么盖玻片是如此之薄。可能配备了简略的剪辑（更廉价显微镜），或与一些幻灯片固定舞台。幻灯片，可能需要手动定位，或有可能是机械的阶段（首选），容许在不触摸滑动精断定位。

优化照明

A光源应当有一个宽广的动态范畴，供给高放大倍率，低强度，高强度的照明，使用户可以查看在低放大倍率的舒适。更好的显微镜有一个内置照明灯，和最好的显微镜对光照强度和外形的光束把持。如果您的显微镜需要一个外部的光源，确保旨在向冷凝器中的光。调整光照，使该字段是不损害眼睛明亮。

调整冷凝器

要调剂和调整的显微镜，开端浏览手册。如果没有可用的手册，请尝试使用这些准则。如果冷凝器是可聚焦，地位与镜头尽量靠近你可以得到它在现阶段开放。如果冷凝器可选择的选项，将它设置为明亮的范畴。光圈开始，才停了下来（高对比度）。您应当看到的光，通过试样转变亮度，当您移动光圈杆。

想想你在找什么

这是一个很大很难找到的显微镜，你有没有期看其apprearance时。它有多大？它会移动吗？它是色素或染色，若有什么是它的色彩吗？你盼望在哪里找到它在幻灯片上？例如，学生由于用肉眼和低放大倍率的显微镜看起来像污垢通常有很多麻烦找到沾上细菌。它有助于懂得涂片干下来，他们通常会留下戒指，使一抹黑的边沿通常有最密集的细胞浓度。

聚焦，定位，和中心的标本

最低放大倍率的物镜，家里的标本和/或您想检讨的标本的一部离开始。找到并重点组织部分，特殊是如果他们是固定的，与大多数筹备幻灯片染色，这是很轻易的。然而，它可以很难找到生涯，如细菌或unpigmented原生生物标天职钟。一个酵母细胞的悬浮液，使得一个好的做法标本，寻找艰苦对象。

应用暗场模式（假如有的话）发明未染色标本。如果没有，开始与高对比度（光圈关闭）。

与标本，重点启动，这样带来的阶段和目的，必需紧密接洽起来。第一面成为关注的焦点，为您带来阶段和客观盖玻片上方。随着涂片，盖玻片经常不使用，所以你首先看到的是涂片本身。

假如您有问题，着眼于盖玻片或气泡，或显微镜，你可以很轻易地辨认边沿。盖玻片的顶部边沿首先成为关注的焦点，然后底部，应在同一平面上为您的标本。

一旦你发明的标本，调整比较度和光照强度，移动幻灯片，直到你有一个好的区域观看。

调整目镜分别，重点

一个单一的眼，没有什么做目镜，除了坚持它的干净。用双目显微镜（首选），你须要调剂目镜的分别，就像你做一个双筒看远镜。双眼视力比单眼视力，光线和细节更敏感，所以如果你有一个双目显微镜，应用它。

一个或两个目镜可伸缩式目镜，那就是，你可以集中精神。由于极少数人的眼睛是完整匹配的，我们最需要的重点工作之一目镜，以配合其他图像。寻找到固定目镜恰当的眼部和重点用显微镜调焦旋钮。接下来，看看可调目镜（与另一只眼睛当然），调剂目镜，显微镜。

选择观看的物镜

功耗最低的镜头通常是3.5或4倍，重要用于最初发现的标本。我们有时正是由于这一原因，扫描镜头。最常用的物镜，是10倍的镜头，给人以10倍的目镜放大倍率的100X的最后。对于非常小的原生生物和筹备幻灯片，如细胞器或核决裂的具体信息，您将需要更高的放大倍率。典范的高倍率镜头，40倍和97x或100倍。后两种放大倍率是用石油专用，以进步辨别率。

按步骤的放大移动。每次往功率更高的目的，重新聚焦和重新中心的标本。高倍率镜头，必需在物理上更接近试样本身，这对干扰到标本的客观风险。对焦时非常谨严。顺便说一下，镜片的质量好集齐焦，也就是说，当您切换放大倍率的标本中的重点仍然或封闭，以集中。

更大并不总是更好。所有的标本有三个方面，一个标本，除非是非常薄的，你将无法对焦用高放大倍率的目标。放大倍率越高，就越难是“追逐”的移动标本。

调整为选定的物镜的照明

无论使用的放大倍率目镜显明的范畴是恒定的。所以，当你进步放大倍率照明试样的面积，你看到的是更小的。既然你是在寻找一个较小的区域，更少的光线达到眼睛，和图像变暗。一个低功耗的目的，你可能要削减光照强度。随着高功率，你须要，特殊是与较昂贵的显微镜，你可以得到所有的光线。

当使用亮场显微镜

亮视野显微镜是最合适观看的染色或自然色素标本，如染色的组织切片或居住的光合生物筹备幻灯片。它是无用的活标本的细菌，和非光合原生生物和后活泼物，或不染的细胞悬液或组织切片下。这里是一个不那么完全列表可能使用明场显微镜察看的标本，和恰当的放大倍率（首选的终极放大倍率强调）的。

编写的幻灯片，彩色 – 细菌（1000倍），厚的组织切片（100X，400X），简明染色体或特别染色的细胞器（1000倍），大型原生生物或后活泼物（100X）的薄片。

涂片，染色 – 血液（400倍，1000倍），负沾上细菌（400倍，1000倍）。

生活的预备工作（湿坐骑，不染） – 池塘里的水（40X，100X，400X），生活的原生生物或后活泼物（40X，100X，400X偶然），藻类和其他微观植物资料（40X，100X，400X）。较小的标本将难以察看到的不失真，特殊是假如他们无色素冷静。

在显微镜的护理

质量好显微镜上的一切是难以置信的昂贵，所以要警惕。

坚持显微镜，只有坚定的态度。不要抢目镜持有人，例如。

拔出照明灯时，握住插头（而不是电缆）。

由于灯泡是昂贵的，有一个有限的性命，当您完成时封闭照明灯。

务必确保舞台和镜头干净敷上了显微镜。

从来不使用纸巾，kimwipe，你的衬衫，或任何其他资料比质量好的镜头纸或棉签（必须是100％自然棉）清洁光学表面。要温顺！您可以使用一个适合的镜头干净水或蒸馏水，以辅助打消干燥物料。有机溶剂可能单独或破坏的镜片或涂料。

盖在不应用时用防尘套仪器。

焦点顺利;不要试图通过聚焦的进程中或强迫任何速度。例如，如果您碰到阻力增大，对焦时，那么你可能已经到达了极限，你在过错的方向。